Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

Здравствуйте, я Джерси. Привет, меня зовут Шаби, мы оба являемся постдокторантами в Имперском колледже Лондона и работаем под руководством профессора Эндрю Ди Мело и доктора Джоша Дела над микрофлюидными капельными платформами. Микрофлюидные платформы на основе капель являются перспективными кандидатами для экспериментов с более высокой пропускной способностью, так как капли могут создаваться с очень высокими и точно определенными объемами, а частота их генерации может достигать нескольких килогерц.

Кроме того, поскольку интересуемая область может быть инкапсулирована в компартменты объемом всего несколько литров, можно исключить как перекрестные помехи, так и дисперсию, а аналитические процессы могут быть синхронизированы с большей точностью. В нашей группе мы уже успешно внедрили платформы на основе микрокапель во многих приложениях. Например, в полимеразной цепной реакции, синтезе наночастиц и одномолекулярном анализе клеток.

Огромные объемы информации, генерируемые в таких системах, должны эффективно извлекаться, обрабатываться и использоваться. В связи с этим выбираемый метод детектирования должен быть подходящим, обладать высокой чувствительностью и низкими пределами обнаружения, быть применимым к различным молекулярным видам, не оказывать разрушающего воздействия и иметь возможность легкой интеграции с микрофлюидными устройствами. Чтобы удовлетворить эти потребности, мы разработали набор экспериментальных инструментов и протоколов, которые позволяют извлекать большие объемы физической информации из сред с малым объемом и применимы для анализа широкого спектра физических, химических и биологических объектов.

В данном протоколе мы представим два метода, применяемых для детектирования одиночных клеток и картирования процессов смешивания в микрофлюидных устройствах. Микрофлюидные чипы традиционно изготавливают из полидиметилсилоксана (PDMS) с использованием методов фотолитографии. Этот процесс следует проводить в чистом помещении для получения микрофлюидных каналов: на кремниевую пластину наносят SU-8 50, затем проводят мягкий обжиг на нагревательной плитке при 65 °C и 95 °C для испарения растворителя и уплотнения пленки; после охлаждения резист SU-8 подвергают воздействию УФ-излучения через соответствующую маску, после чего пластину обжигают при 65 °C и 95 °C после охлаждения.

Проявите неэкспонированные области с помощью соответствующего проявителя при перемешивании. Используйте свежий растворитель EC для промывки пластины, затем высушите ее струей газа для получения чистой поверхности. Обработайте пластину путем промывки гексаном и метанолом.

Для завершения процесса изготовления мастер-формы эстата нанесите методом испарения связующий агент на поверхность в эксикаторе в течение 40 минут. Чтобы сформировать структурированные микрофлюидные подложки, смешайте S guard 1 8 4 в соотношении смолы и сшивающего агента 10:1 и нанесите эту смесь на мастер-форму. Удалите пузырьки воздуха (дегазируйте) в эксикаторе и отвердите устройство при температуре 65 градусов.

Вырежьте отвержденный PDMS и отделите его от формы. С помощью биопсийного панча создайте отверстия для подключения жидкостных трубок. Отверждайте следующий слой PDMS в течение 20 минут при 65 °C.

Поместите подготовленный верхний слой на нижний слой и подвергните полимеризации в течение ночи при 65 °C. Отделите чипы от чашки Петри и нарежьте на кусочки. После изготовления чипы готовы к использованию путем подачи необходимых растворов.

Заполните шприцы необходимыми растворами, убедившись, что в трубках не осталось пузырьков воздуха. Для генерации капель используются две фазы. Водная дисперсная фаза содержит интересующие реагенты.

Масляная фаза служит непрерывной фазой. Соедините трубки того же внутреннего диаметра, что и кончики игл шприцев, с одним концом игл; установите шприцы на шприцевой насос и задайте требуемую скорость подачи. Для каждой фазы рекомендуется минимальное соотношение скоростей потоков масла и водной фазы, равное единице, чтобы избежать смачивания PDMS водной фазой, что привело бы к нестабильному формированию капель. Подсоедините другие концы трубок непосредственно к отверстиям, пробитым в подложке из PDMS.

Для создания более сложных систем также могут быть использованы кварцевые капиллярные порты или соединители. Подключите выходной порт чипа к трубке и направьте её в коллектор для сбора отходов или дальнейшего анализа. После завершения настройки возможны две основные конфигурации микроканалов для генерации капель: фокусировка потока или T-образный соединитель; в обоих случаях формирование капель происходит за счет сил сдвига, возникающих при сведении двух несмешивающихся жидкостей в данных геометриях, и последующего развития капиллярной нестабильности на границе раздела фаз.

Спонтанно генерируются однородные дисперсные капли объемом всего несколько фемтолитров. После генерации капель их можно исследовать с помощью оптической установки. Оптическая система настраивается согласно следующему протоколу.

Используйте конфокальный микроскоп с возможностью автоматизированного субмикронного позиционирования и лазер, работающий на длине волны, соответствующей спектру поглощения используемых флуорофоров. Для их возбуждения при получении изображений времени жизни флуоресценции используйте импульсный лазер с частотой повторения импульсов несколько мегагерц. В экспериментах со слизью используются отклоняющие зеркала и оптика для контроля как высоты, так и направления луча.

Используйте дихроичное зеркало для направления лазерного луча в объектив. При одновременном использовании двух лазеров можно установить двухполосное дихроичное зеркало. Чтобы обеспечить отражение двух лазерных лучей, используйте микроскопический объектив с высокой числовой апертурой NA и коррекцией бесконечности для фокусировки лазерного излучения в узкий пучок внутри микрофлюидного канала.

Соберите флуоресценцию, излучаемую образцом внутри микрофлюидного канала, используя тот же объектив с высокой NA, при этом свет должен проходить через то же дихроичное зеркало. Удалите остаточный возбуждающий свет с помощью одно- или двухполосного эмиссионного фильтра. Сфокусируйте флуоресцентное излучение на диафрагме (пинхоле) размером 75 микрометров.

Используйте плосковыпуклую линзу. Расположите диафрагму в конфокальной плоскости объектива микроскопа. Используйте еще одно дихроичное зеркало, чтобы разделить флуоресцентный сигнал на два детектора.

Отфильтруйте флуоресценцию, отраженную дихроичным зеркалом, с помощью эмиссионного фильтра и сфокусируйте ее плосковыпуклой линзой на первый детектор. Для экспериментов с использованием вторичного красного флуорофора отфильтруйте флуоресценцию, прошедшую через дихроичное зеркало, с помощью другого эмиссионного фильтра, а затем сфокусируйте ее другой плосковыпуклой линзой на второй детектор. Для регистрации фотонов флуоресценции используйте лавинные фотодиоды.

Для сбора данных флуоресценции подсоедините электронный сигнал от лавинного фотодиода к многофункциональному устройству сбора данных (DAQ) для регистрации данных на персональном компьютере. Для экспериментов с мокротой используйте импульсный лазер и подключите детекторы к плате ПК для регистрации одиночных фотонов с временным разрешением (TCS), установленной в отдельный компьютер. Данная плата позволяет получать данные о времени жизни флуоресценции.

С использованием методики TCS PC. Каждый зарегистрированный флуоресцентный фотон коррелирует с падающим лазерным импульсом, и поэтому каждому излученному флуоресцентному фотону присваивается время задержки. Эти данные можно аппроксимировать одной или несколькими экспоненциальными кривыми затухания для получения оценки скорости излучения флуорофоров.

В настоящее время известно, что клетки крайне гетерогенны с биологической, физической и химической точек зрения. Следовательно, в идеале следует анализировать каждую клетку по отдельности. Однако анализы должны проводиться с высокой пропускной способностью, чтобы мы могли собрать достаточное количество количественной информации для получения надежных и значимых выводов.

Ниже представлен пример инкапсуляции клеток e coli в отдельные капли для демонстрации данной процедуры. Используйте штамм e coli TOP10, выращенный в течение ночи. Для определения жизнеспособности клеток используйте cyto nine и пропидий йодид.

Оба красителя являются интеркалирующими красителями ДНК, и интенсивность их флуоресценции увеличивается более чем в 20 раз. При связывании с ДНК cyto nine представляет собой зеленый флуоресцентный краситель, проникающий через мембраны, а пропидий иодид — красный флуоресцентный краситель, не проникающий через мембраны.

Таким образом, живые клетки флуоресцируют зеленым, тогда как мертвые клетки демонстрируют как зеленое, так и красное излучение. Здесь мы видим процесс генерации капель и инкапсуляцию одной клетки с помощью T-образного соединителя. Данное видео было записано на высокоскоростную камеру, однако скорость генерации капель может достигать тысяч в секунду.

При инкапсуляции клеток необходимо убедиться, что культура клеток разведена таким образом, чтобы количество клеток было меньше количества генерируемых капель, а также предотвратить седиментацию клеток, которая может произойти в шприце или трубках. Чтобы клетки оставались равномерно распределенными в раствое, используйте внутри шприца магнитный перемешиватель. Для соединения шприца с микрочипом используйте очень тонкие трубки диаметром 50 мкм.

Это обеспечивает высокую скорость потока внутри трубки и, следовательно, предотвращает седиментацию клеток. Ниже представлены типичные примеры количества зарегистрированных фотонов в зависимости от времени для экспериментов с использованием клеток. Для картирования процессов смешивания внутри капель.

Капли могут быть сформированы с использованием двух различных флуорофоров с разным временем жизни. Внутри текущей капли создается поле потока, которое в конечном итоге перемешивает два изначально разделенных раствора для интенсификации процесса смешивания. Симметрия поля потока может быть изменена за счет использования извилистых каналов.

Для исследования капель сфокусируйте объем оптического зондирования на половине высоты микроканала, по которому перемещаются капли. Начиная с одного края канала, проведите каждый эксперимент по всей его ширине с интервалом в один микрометр. Примените алгоритм для дифференциации одиночных всплесков, связанных с каплями, от шумового фона масляной фазы, и для определения продолжительности каждого всплеска.

Реализуйте второй алгоритм для извлечения значений времени задержки и интенсивности вдоль всей длины каждой капли при той ширине, при которой проводился эксперимент. Затем используйте алгоритм оценки максимального правдоподобия (MLE) для определения времени жизни флуоресценции каждой капли в эксперименте. Усреднение значений времени жизни для всех капель в эксперименте позволяет снизить конечную погрешность расчета MLE.

Чем больше исследовано капель, тем меньше погрешность после получения траектории времени жизни. Для каждой ширины объедините все траектории на 2D-карте. Поскольку каждое значение времени жизни связано с определенной смесью двух флуорофоров, таким образом можно получить карту концентраций или смешивания.

Мы описали изготовление микроустройства, экспериментальную установку и соответствующие протоколы для формирования микрокапель, инкапсуляции реагентов и оптического детектирования процесса образования капель. В качестве двух примеров были выбраны детектирование одиночных клеток в каплях и картирование процессов смешивания внутри движущейся капли; данные примеры представляют собой типичные области применения, которые в настоящее время исследуются с помощью капельной микрофлюидики.

Как показывают представленные эксперименты, использование платформ капельной микрофлюидики обладает такими привлекательными характеристиками, как высокая пропускная способность за счет идеального ограничения объема и более высокая воспроизводимость. Большой объем генерируемой информации и высокая скорость ее получения требуют применения методов экспресс-детектирования с максимально высоким пространственно-временным разрешением для полноценного использования преимуществ этих миниатюризированных платформ.

В данном случае мы демонстрируем, что это возможно с помощью высокоточных методов фторной спектроскопии.