Синтез, монтаж, и характеристика монослоя охраняемые пленок золота наночастицы для Белки электрохимии монослоя

Общая цель следующего эксперимента заключается в синтезе стабилизированных алкилатами наночастиц золота, известных как кластеры с монослойной защитой (MPCs), и сборке этих материалов в тонкопленочные структуры, используемые в качестве абсорбционного интерфейса для электрохимии монослоев белка азарина. Это достигается путем первоначальной защиты коллоидов золота органическими лигандами для создания наночастиц золота, окруженных пленкой алкантиолятов. Затем MPCs закрепляются на золотых и стеклянных подложках и объединяются в тонкие многослойные ковалентно связанные пленки, рост которых отслеживается с помощью оптических и электрохимических измерений, а также микроскопии поперечного сечения.

Затем белок переноса электронов азарин адсорбируется на границе раздела, и проводится циклическая вольтамперометрия для изучения электрохимии белкового монослоя. Результаты показывают, что границы раздела пленок MPC, созданные с помощью данной процедуры, позволяют проводить более оптимизированный электрохимический анализ адсорбированного белка на основе пленки MPC, обеспечивая более однородную поверхность адсорбции и быструю кинетику переноса электронов, лишенную традиционной зависимости от расстояния. Основным преимуществом данного метода перед традиционной электрохимией белков является то, что электроды, модифицированные пленками наночастиц, обеспечивают поверхность адсорбции, которая приводит к более идеальному электрохимическому поведению по данным циклической вольтамперометрии.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как синтез включает важные визуальные признаки, а создание и характеристика пленок предполагают множество сложных этапов и аналитических методов. Пленки NPC можно наносить на модифицированные золотые электроды или стеклянные подложки, используя метод циклического погружения с чередованием слоев MPC и молекул диле-связки. Следовательно, за формированием этих слоев можно отслеживать электрохимически или оптически до достижения желаемой толщины пленки.

Для синтеза золотых кластеров в вытяжном шкафу с соответствующей вентиляцией начните с растворения 1,1 г тетрабутиламмоний бромида в 30 мл толуола; растворите 0,38 г боргидрида натрия примерно в 20 мл ультрачистой воды с удельным сопротивлением 18 МОм и выдержите на льду не менее 30 минут. Затем количественно перенесите раствор тетрахлорозолотой кислоты в раствор тетрабутиламмоний бромида в толуоле, используя дополнительные 5 мл ультрачистой воды. Для фазового переноса водного раствора золота в неводный раствор слегка закройте емкость крышкой и интенсивно перемешивайте в течение 30 минут.

Таким образом, темно-оранжевая водная и прозрачная неводная фазы тщательно перемешиваются. Перенесите обе фазы — прозрачную водную и темно-оранжевую неводную — в делительную воронку. Удалите водный слой и слейте неводный слой в чистую колбу.

Добавьте C six в соотношении два к одному в неводный раствор, содержащий hydrogen tetra chloro or rate. Перемешивайте в течение 30 минут до образования полимера золота(I), что подтверждается изменением цвета раствора с красно-оранжевого на бледно-желтый, почти бесцветный. Перенесите реакционную смесь в термоизолированную ледяную баню и охладите до 0 °C в течение не менее 30 минут при перемешивании; затем количественно и быстро добавьте охлажденный раствор боргидрида натрия в реакционную смесь для восстановления золота(I) до металлического золота в присутствии thighs.

После добавления мгновенно образуется густой черный раствор монослойно-защищенных золотых кластеров (MPC). Перемешивайте реакционную смесь в течение ночи при температуре 0 °C, после чего на следующий день перенесите ее в делительную воронку.

Слейте водный слой в стакан для отходов и используйте роторный испаритель. Испаряйте неводный слой толуола почти досуха, пока в колбе не останется густой черный осадок. Осадите MPC, добавив ацетонитрил, и оставьте раствор на ночь, используя стеклянный фильтр средней пористости с резиновыми уплотнителями и колбу с боковым отводом и аспиратором.

Соберите MPC путем вакуумной фильтрации и промойте большим количеством ацетонитрила. После электрохимической сборки сэндвич-ячейки очистите золотую подложку, выполнив циклическую вольтамперометрию (ЦВА) в диапазонах потенциалов от 0,2 до 0,9 В, от 0,2 до 1,2 В и от 0,2 до 1,35 В при скорости сканирования 100 мВ/с в растворе 0,1 М серной кислоты и 0,01 М хлорида калия. Измерьте ток зарядки двойного слоя очищенной чистой золотой подложки, выполнив ЦВА в стандартных условиях, что включает диапазон потенциалов от 0,1 до 0,4 В относительно хлорида серебра при скорости сканирования 100 мВ/с в калий-фосфатном буфере (KPB).

Слейте буфер и дважды тщательно промойте подток ультрачистой водой и этанолом. Нанесите на очищенную золотую подложку около 300 µL 5 мМ раствора C6 в этаноле и оставьте на ночь для формирования упорядоченного самособранного слоя C6. Слейте раствор C6 из кюветы и дважды тщательно промойте ее этанолом и ультрачистой водой.

Измерьте ток зарядки САМ при стандартных условиях. Удалите КФБ и дважды тщательно промойте поверхность ультрачистой водой и этанолом. Ток зарядки должен заметно снизиться.

После проведения измерений на чистом золоте подвергните модифицированную SAM золотую подложку воздействию примерно 300 мкл 5 мМ раствора NDT в этаноле и оставьте на один час для интердиспергирования молекул сшивки NDT внутри C6 SAM. Удалите раствор NDT и дважды тщательно и обильно промойте подложку этанолом и ультрачистой водой, а затем один раз диметилметананом. Подвергните золотую подложку воздействию раствора MPC в диметилметанане при перемешивании путем медленного барботирования азотом в течение одного часа.

Это закрепляющий слой MPC пленочной сборки. Удалите раствор MPC и снова последовательно промойте дихлорметаном, ультрачистой водой и KPB. Измерьте ток зарядки слоя MPC при стандартных условиях.

Слейте KPB и тщательно промойте поверхность ультрачистой водой и DIAM-метаном. Нанесите на золотую подложку около 300 мкл 5 мМ раствора NDT в DIAM-метане, обеспечив перемешивание путем медленного пропускания газообразного азота в течение 20 минут. Слейте NDT и тщательно промойте поверхность DIAM-метаном для осаждения второго слоя MPC.

Снова погрузите сборку с пленкой в раствор MPC из DIAM метана и оставьте ее на один час, обеспечивая перемешивание путем медленного пропускания азота, предварительно промыв образец. Затем снова измерьте ток зарядки слоя MPC при стандартных условиях и повторите промывку по той же процедуре. При необходимости нанесите дополнительные слои MPC.

После завершения формирования сетчатой пленки MPC промойте модифицированную подложку раствором KPB для адсорбции белка AZ на сборке пленки MPC. Введите около 150 µL раствора AZ в KPB с концентрацией от 5 до 10 µM в электрохимическую сэндвич-ячейку, закройте её и выдержите в холодильнике не менее одного часа. После того как ячейка с внеклеточным матриксом (ECM) достигнет комнатной температуры, тщательно промойте её раствором KPB, снова заполните ячейку KPB и продувайте её газообразным азотом в течение 10 минут.

Проведите электрохимические исследования монослоя, такие как циклическая вольтамперометрия (ЦВА), в окне потенциалов от -0.25 volts до 0.25 volts. Сканирование выполняйте со скоростью 100 millivolts в секунду в растворе KPB Rinse A. Модифицируйте предметное стекло 3M PT MS с помощью DIAM methane и поместите его в раствор MPC с DIAM methane на один час, перемешивая на шейкере на низкой скорости. Таким образом завершается формирование первого слоя MPC в структуре пленки путем прикрепления MPC к концевым группам ME captan поверхности.

Тщательно промойте предметное стекло диметилметананом, высушите его потоком азота и снимите УФ-вид спектр стекла после замачивания в растворе NDT в диметилметаноле. Поместите стекло в раствор MPC на один час, перемешивая на шейкере на низкой скорости. Это завершает формирование второго слоя MPC в структуре пленки.

Тщательно промойте предметное стекло DIAM-метаном, высушите потоком азота и снимите УФ-видимый спектр образца. Поглощение в спектре должно увеличиваться по мере адсорбции дополнительных слоев MPC на сборку пленки. Чтобы перенести пленку MPC, сформированную на модифицированном 3M PT MS стекле, на стандартное предметное стекло для микроскопа.

Приготовьте эпоксидную смолу Embed eight 12 и дайте ей загустеть в течение как минимум 12 часов. Заполните капсулу для пучка эпоксидной смолой и переверните ее поверх образца пленки MPC. Надавите на капсулу так, чтобы пузырек воздуха поднялся к ее верхней части, обеспечив герметичное соединение между эпоксидной смолой и образцом пленки MPC.

Оставьте образец для полимеризации минимум на 18 часов при 60 °C, после чего охладите закрепленные предметные стекла до комнатной температуры. Нагрейте закрепленные стекла в течение 20 секунд на алюминиевой плитке при 200 °C, чтобы облегчить отделение блока с прикрепленным MPC на быстрой пленке. Отрежьте образец, содержащий пленку, от блока капсулы луча с помощью ювелирного лобзика, затем поместите отделенную часть в плоскую силиконовую форму стороной с пленкой MPC вверх, лицом к внутренней поверхности силикона.

Заполните силиконовую лунку эпоксидной смолой при комнатной температуре и оставьте для полимеризации минимум на 18 часов при 60 °C. Затем охладите образец до комнатной температуры. С помощью ультрамикротома Leica UCT и алмазного ножа нарежьте тонкие срезы образца толщиной от 60 до 80 нм перпендикулярно режущей кромке ножа. Поместите полученные срезы на поддерживающую углеродную пленку Formvar на медных сетках с размером ячейки 400 mesh и выполните ПЭМ-съемку поперечных сечений представленных сборок пленок MPC.

Ниже представлены результаты мониторинга тока зарядки двойного слоя при выращивании пленки MPC в течение пяти циклов погружения с попеременным воздействием растворов MPC и NDT. Токи зарядки систематически увеличиваются с каждым циклом погружения. Таким образом, на пленку наносятся слои MPC.

Ниже представлена типичная циклическая вольтамперограмма для сборки MPC-пленки с добавлением AZ, полученная в диапазоне потенциалов от -0,25 до +0,25 В при скорости сканирования 100 мВ/с в 4,4 мМ калий-фосфатном буфере. Здесь показан репрезентативный спектр УФ-видимого мониторинга роста MPC-пленки с диольным линкером на стеклянном предметном стекле, модифицированном 3M PT MS. Цикл погружения состоит из воздействия на стеклянное стекло раствора линкера NDT с последующим воздействием раствора MPC.

Каждое последующее погружение приводит к увеличению толщины пленки и соответствующему росту оптической плотности. На этом рисунке представлен анализ поперечного сечения пленки из MPC, связанных через DIA, полученный с помощью просвечивающей электронной микроскопии. На вставке показано типичное ПЭМ-изображение функционализированных гексаметолом MPC, использованных в анализе структуры пленки методом ПЭМ.

С помощью программы Image J было установлено, что средний диаметр золотого ядра MPC составляет около двух нанометров. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как синтезировать, характеризовать и собирать тонкие пленки из MPC с золотыми наночастицами, которые служат интерфейсом для адсорбции и последующего электрохимического анализа редокс-белков. Процесс сборки пленки легко адаптируется путем изменения процедуры синтеза MPC, а также механизма связи между частицами для обеспечения адсорбции широкого спектра белков.

Хотя данный метод позволяет получить представление об электрохимии адсорбции белков на модифицированных синтетических платформах, он также может быть применен при разработке систем моделирования переноса электрона, схем биосенсоров и синтетических биосовместимых материалов.