Поверхностные мышей хирургии лимфатических узлов
21 мая 2012 г.
Чтобы проследить прогрессирование иммунного ответа с течением времени в той же мыши, лимфатические узлы могут быть последовательно удалены хирургическим путем. Здесь мы опишем, как эта техника может быть выполнена.
Общая цель данной процедуры заключается в хирургическом удалении лимфатических узлов у анестезированной мыши. Это достигается путем предварительной локализации лимфатических узлов. Затем производится забор лимфатических узлов, после чего разрез закрывается.
Наконец, для экспериментального анализа можно получить суспензию единичных клеток. В конечном итоге жизнеспособные популяции лимфоцитов могут быть оценены с помощью проточной цитометрии. Визуальная демонстрация этой методики имеет решающее значение, так как для её освоения необходимо видеть процесс локализации и удаления лимфатических узлов.
После анестезии мыши нанесите глазную мазь, введите бупренорфин и подтвердите седацию с помощью щипкового теста (сдавливания пальца лапы), затем положите мышь на бок. Сначала локализуйте подмышечный лимфатический узел, после чего выбрейте область, подлежащую диссекции. Смахнув все отделившиеся волоски, обработайте область антисептиком, затем сделайте небольшой разрез длиной около пяти миллиметров на тыльной стороне передней лапы.
Используйте два пинцета, чтобы растянуть разрез до тех пор, пока не станет виден плечевой лимфатический узел, который может иметь сероватый цвет или быть темнее окружающего жира. Затем захватите фасцию, покрывающую лимфатический узел, одним пинцетом. Поместите второй пинцет как можно глубже под лимфатический узел и осторожно потяните за мембрану, не повреждая окружающие ткани.
Затем с помощью первого пинцета разорвите фасцию и извлеките лимфатический узел. Если лимфатический узел был успешно извлечен, в месте его прежнего нахождения появится пятно крови. Поместите иссеченный лимфатический узел в изотонический раствор; если он погрузится на дно, это подтвердит, что извлеченная ткань является лимфатическим узлом, а не жировой тканью.
Затем убедитесь, что в ране нет волосков, и закройте разрез, соединив внутренние края кожи и зафиксировав их одной или двумя скобами, в зависимости от размера разреза. Теперь найдите паховый лимфатический узел и выбрейте область, подлежащую диссекции. После удаления всех выпадающих волосков обработайте область дезинфицирующим средством, а затем сделайте небольшой разрез длиной около пяти миллиметров выше задней лапы, рядом с брюшной полостью.
После того как разрез был раскрыт двумя парами пинцетов, как было показано ранее для плечевого лимфатического узла, найдите паховый лимфатический узел, расположенный в окружающей жировой ткани. Затем удалите лимфатический узел двумя парами пинцетов, как было продемонстрировано. Снова подтвердите успешное извлечение лимфатического узла, отметив появление пятна крови в месте, где ранее находился узел, после чего поместите паховый лимфатический узел в отдельный контейнер с изотоническим раствором.
После извлечения всех лимфатических узлов поместите мышь в клетку и добавьте влажный корм, чтобы животное могло легко питаться. Примерно через шесть-восемь часов после операции осмотрите мышь, чтобы убедиться в отсутствии болевого синдрома. Внимательно проследите, чтобы поза, походка, взаимодействие с сородичами и внешний вид шерсти соответствовали показателям здоровой мыши.
Наконец, диссоциируйте лимфатический узел, прижимая его к матовым предметным стеклам в чашке Петри, а затем перенесите его в пробирку для получения суспензии одиночных клеток. После окрашивания клеток на интересующие антигены клеточной поверхности проанализируйте клетки методом проточной цитометрии. Здесь представлены примеры диаграмм прямого и бокового светорассеяния для лимфатических узлов, полученных от анестезированных или забитых животных.
Профили и процентное содержание клеток в гейтах живых лимфоцитов на двух диаграммах рассеяния идентичны. Это доказывает, что хирургическое выделение лимфатического узла является подходящим методом сбора клеток. После освоения данной техники операция по извлечению лимфатического узла может занимать от 5 до 10 минут на одну мышь при условии правильного выполнения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается хирургический метод последовательного удаления лимфатических узлов у мыши под наркозом для отслеживания иммунного ответа в динамике. Процедура включает локализацию лимфатических узлов, их извлечение и ушивание разреза с последующим получением суспензии одиночных клеток для анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Хирургические методы
- Экспериментальный анализ
Теоретические основы
- Понимание иммунных ответов имеет критическое значение для исследований.
- Лимфатические узлы играют ключевую роль в иммунной системе.
- Последовательное удаление позволяет проводить временной анализ иммунных ответов.
- Визуальные методы обучения способствуют лучшему освоению и отработке данной процедуры.
Цель исследования
- Продемонстрировать хирургическое удаление лимфатических узлов у мышей.
- Способствовать изучению прогрессирования иммунного ответа.
- Предоставить визуальное руководство для исследователей.
Используемые методы
- Локализация лимфатических узлов у мыши под наркозом.
- Хирургическое удаление лимфатических узлов.
- Закрытие разреза после операции.
- Приготовление суспензии единичных клеток для анализа.
Основные результаты
- Было достигнуто успешное удаление лимфатических узлов.
- Были получены жизнеспособные популяции лимфоцитов.
- Для анализа лимфоцитов использовался метод проточной цитометрии.
- Визуальные демонстрации позволили лучше понять методику.
Выводы
- Данный метод позволяет эффективно отслеживать иммунные ответы.
- Визуальные пособия необходимы для освоения хирургических процедур.
- Будущие исследования могут основываться на этом методе для более глубокого изучения вопроса.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Последовательная хирургическая операция по удалению лимфатических узлов позволяет осуществлять лонгитюдный мониторинг иммунных ответов у одного и того же животного, что снижает экспериментальную вариативность и способствует механистическому снижению рисков при валидации мишеней. Данный подход обеспечивает получение достаточного количества жизнеспособных лимфоцитов для фенотипического и функционального анализа, повышая прогностическую достоверность доклинических иммунологических исследований. Облегчая проведение экспериментов с временным контролем, этот метод обеспечивает трансляционную непрерывность на пути от этапа открытия до доклинической валидации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством временного анализа экспансии лимфоцитов в лимфатических узлах.
- Практическая ценность: сокращает количество используемых животных и экспериментальную вариабельность за счет многократного забора проб у одной и той же мыши.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков путем характеристики фенотипов лимфоцитов, локализованных в лимфатических узлах, в динамике.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получить 1-2x10⁶ клеток из одного лимфатического узла, что достаточно для фенотипической характеристики и функциональных анализов.
- Практическая ценность: Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых клеточных суспензий для последующего анализа методом проточной цитометрии.
- Научная ценность: Позволяет подготавливать валидированные биологические системы для надежной оценки соединений при иммунологическом скрининге.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает моделирование систем, имеющих значение для изучения заболеваний, путем отслеживания динамики иммунных клеток в лимфатических узлах с течением времени.
- Практическая ценность: Способствует согласованию трансляционных биомаркеров посредством лонгитюдного иммунного мониторинга.
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, позволяя снизить риски за счет механического анализа иммуноопосредованных путей.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в континуум научных открытий — от проверки гипотез до доклинической валидации, обеспечивая мониторинг иммунного ответа и функциональный анализ лимфоцитов.
- Фундаментальная биология: поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством временного профилирования иммунного ответа.
- Скрининг: обеспечивает готовность к проведению анализа за счет получения воспроизводимых суспензий единичных клеток из извлеченных лимфатических узлов.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные о популяциях лимфоцитов для сравнительного анализа различных временных точек с помощью проточной цитометрии.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с доклинической валидацией посредством непрерывного иммунного мониторинга в моделях соответствующих заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: представляет собой воспроизводимую хирургическую методику для лонгитюдных иммунологических исследований в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в валидации мишени посредством лонгитюдного отслеживания иммунного ответа.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость процедур сбора и обработки лимфоцитов.
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности в иммунологических программах.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе временны́х данных иммунного ответа, полученных в результате последовательного отбора проб.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области хирургических техник и протоколов анестезии для мышей.
- Необходимы стерильные инструменты и изотонические растворы для сохранения тканей.
- Требуется стандартизация между группами исследователей для обеспечения единообразия локализации и забора лимфатических узлов.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных сайтов лимфоузлов (плечевых, паховых) и линий мышей.
- Ограничено интервалами послеоперационного восстановления, что позволяет проводить забор проб из каждого узла раз в два дня.
