Электрическое поле контролируемых Режиссер миграции нервных клеток предшественников в 2D и 3D среде

Общая цель данной процедуры заключается в регистрации влияния приложенных электрических полей на миграцию нейральных клеток-предшественников в 2D-культуре и 3D ex vivo моделях. Это достигается путем первоначального выделения и экспансии нейральных клеток-предшественников in vitro. Вторым этапом является подготовка суспензии одиночных нейральных клеток-предшественников.

Затем, для подготовки 2D-культуры, нейральные клетки-предшественники высевают в специально сконструированные электRotaктические камеры. В качестве альтернативы, для подготовки 3D-модели ex vivo, нейральные клетки-предшественники маркируют с помощью hooks 3, 3, 3, 4, 2 и вводят в органотипическую модель среза спинного мозга. В конечном итоге на электрокамеры подают электрическое поле и проводят таймлапс-запись, чтобы показать, что клетки-предшественники мигрируют к катоду электрического поля как в 2D-, так и в 3D-средах.

Основным преимуществом данного метода является то, что он представляет собой новый способ отслеживания в режиме реального времени миграции отдельных клеток под воздействием электрического поля после их трансплантации в 3D-органотипическую модель, максимально приближенную к естественной среде. Этот метод позволяет не только изучить особенности электротаксиса и миграции нейрональных клеток, трансплантированных в срез спинного мозга, но и может быть применен к другим системам, таким как модели срезов мозга. Для начала данной процедуры подготовьте стеклянные полоски размером 22 на 11 мм, разделив автоклавированные квадраты размером 22 на 22 мм.

Разрежьте покровные стекла толщиной номер 1 пополам с помощью алмазного резца. Затем создайте свободностоящую стеклянную лунку с внутренними размерами 22 на 10 мм, склеив четыре вертикально установленные полоски стекла размером 22 на 11 мм с помощью высоковакуумной силиконовой смазки; оставьте лунку до полного высыхания и затвердевания на ночь. На следующий день прикрепите две стеклянные полоски размером 22 на 11 мм параллельно друг другу с зазором 10 мм к основанию культуральной чашки диаметром 100 мм, используя силиконовую смазку.

Затем герметизируйте область между этими полосками, закрепив покровное стекло размером 22 by 22 millimeter с помощью силиконовой смазки. Установите стеклянную лунку на покровные стекла таким образом, чтобы внутренние стенки образовывали замкнутое пространство для посева клеток. Сделайте все стыки водонепроницаемыми, используя силиконовую смазку.

Последовательно покройте эту ограниченную область поли-D-лизином, а затем ламинином, как описано в сопроводительной рукописи. В рамках данной процедуры извлеките головной мозг мышей на стадиях от E 14 до E 16 и поместите его в холодную базальную среду D-M-E-M-F 12. Затем удалите мозговые оболочки под анатомическим микроскопом.

После этого перенесите мозг в чашку Петри диаметром 35 мм. С помощью тонкого пинцета измельчите мозг на фрагменты ткани. Затем перенесите их в центрифужную пробирку объемом 15 мл.

Образцы центрифугировали при 800 RPM в течение трех минут для удаления клеточного дебриса. Затем в образцы добавляли DMEM-F 12, содержащий BFDF и DGF. Смешивали содержимое с помощью дозатора на один миллилитр.

Затем с помощью клеточного фильтра получите суспензию одиночных клеток. Расселите клетки по флаконам в концентрации от 20 000 до 50 000 клеток на миллилитр. После этого каждые три дня проводите полную замену среды, которая включает центрифугирование клеток при 1 300 RPM в течение пяти минут.

Удалите супернатант, перенесите нейросферы в свежую среду и верните клетки во флакон каждые шесть дней (минимум через пять). Перенесите нейросферы в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 1 500 об/мин в течение пяти минут. Удалите супернатант.

Ресуспендируйте осадок в трипсинизированном EDTA для получения суспензии одиночных клеток. Перед подсчетом клеток приготовьте один миллилитр суспензии, содержащей 10 000 клеток. Затем удалите ламинин из стеклянной лунки и дайте ей полностью высохнуть.

Замените его одним миллилитром клеточной суспензии. После этого поместите чашку в инкубатор при 37 °C минимум на четыре часа для обеспечения адгезии клеток. Когда клетки достигнут достаточной конфлюэнтности, удалите среду из камеры.

Осторожно удалите стекло. Затем сформируйте «крышу» над клетками, аккуратно закрепив автоклавированное покровное стекло размером 22 by 22 мм между двумя полосками размером 22 by 11 мм с помощью силиконовой смазки. Не забудьте добавить на клетки несколько капель среды, чтобы предотвратить их высыхание.

Затем создайте изолированные резервуары со средой по каждому краю камеры, сформировав два водонепроницаемых барьера из силиконовой смазки, проходящих от одного края чашки до другого. Заполните камеру свежей средой, обеспечив её проточность от одного резервуара к другому. После этого верните чашку в инкубатор на 12 часов для восстановления клеток.

На следующем этапе подготовьте крышку для чашки, просверлив в ней два отверстия, каждое из которых должно располагаться над соответствующим резервуаром миграционной камеры. Затем замените среду в камере на культуральную среду, содержащую 25 мм буфера HEPES. После этого перенесите чашку в систему визуализации с контролируемой температурой.

Установите экспериментальные параметры для записи в режиме таймлапс и многопозиционной съемки. Сориентируйте камеру таким образом, чтобы катод и анод располагались слева и справа соответственно; это обеспечит горизонтальное направление вектора электрического поля при наблюдении под микроскопом и записи в системе визуализации. Затем наполните два стакана.

С использованием раствора Штайнберга. Соедините каждый резервуар со средой с отдельным стаканом с помощью заранее подготовленных стеклянных мостиков, заполненных 2% раствором агара Штайнберга. Затем поместите серебряные электроды, подключенные к источнику постоянного тока, в раствор Штайнберга.

Для каждого стакана установите регулятор напряжения на блоке питания на ноль и включите его. Измеряйте напряжение на электроделящей камере с помощью вольтметра, постепенно поворачивая регулятор напряжения. Затем установите значение напряжения в соответствии с требованиями эксперимента.

После этого начните запись в режиме таймлапса. Произведите замену среды и при необходимости снова отрегулируйте напряжение. Каждый час в резервуары можно добавлять свежую среду, препараты или химические агенты по мере необходимости.

Используйте дополнительные отверстия, просверленные в крышке чашки для культивирования, по одному над каждым резервуаром с питательной средой. На данном этапе проведите диссекцию поясничных отделов спинного мозга двухнедельных мышей. Затем с помощью тканевого чоппера Machel-Wane под анатомическим микроскопом нарежьте спинной мозг на срезы толщиной 500 micron.

Разделите срезы и выберите те, в которых структура спинного мозга в сагиттальной и аксиальной плоскостях не повреждена. Затем поместите срезы в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 30 µL MA-геля. Расположите их максимально близко к центру.

Выдержите их в инкубаторе с 5% carbon dioxide при 37 °C в течение как минимум 30 минут. Для самосборки белков Matrigel с образованием тонкой пленки, покрывающей поверхность срезов спинного мозга, крайне важно, чтобы процесс полимеризации Matrigel завершился полностью. При необходимости инкубируйте чашку Петри при 37 °C еще 30 минут, затем добавьте от 4 до 6 мл среды DMEM-F12, содержащей 25 мМ буфера HEPS и 15–20% fetal calf serum.

Очень осторожно, чтобы избежать прямого попадания среды на срезы, убедитесь, что срезы не погружены в среду полностью и поверхность баклажанов хорошо открыта для доступа воздуха. Меняйте среду дважды в неделю. Теперь инкубируйте суспензию нейральных клеток-предшественников в среде с 5 µM хуков.

3, 3, 3, 4, 2 в течение 30 минут. Под микроскопом с помощью стеклянной капиллярной трубки микроинъектируйте два микролитра суспензии в срез спинного мозга. Медленно убедитесь, что капиллярная стеклянная трубка проходит сквозь матригель и достигает внутренних слоев среза спинного мозга.

Оставьте стеклянную трубку внутри среза спинного мозга минимум на 30 seconds, чтобы избежать взвеси клеток. Затем поместите чашку Петри со срезом спинного мозга в инкубатор при 37 °C с 5% carbon dioxide на ночь. На следующий день сконструируйте электродатическую камеру вокруг среза спинного мозга, содержащую крючки 3 3 3 4 2 с маркированными нейрогенными клетками, перед подачей электрического поля напряженностью 500 mV/mm.

Здесь нейральные клетки-предшественники демонстрируют высоконаправленную миграцию к катоду при воздействии электрических полей; красные линии и синие стрелки представляют траектории и направление движения клеток соответственно. А здесь представлен график показанных путей миграции. Здесь нейральные клетки-предшественники помечены маркерами 3 3, 3, 4 2.

Их пересаживали в органотипический срез спинного мозга в начале обработки электрическим полем. После того как нейральные клетки-предшественники направленно мигрировали к катоду в течение 2,5 часов, полярность электрического поля была изменена. Смена полярности электрического поля вызвала резкий разворот оси миграции в сторону нового катода.

На данном изображении представлены трансплантированные нейральные клетки-предшественники в срезе спинного мозга. В конце записи таймлапса представлена 3D-реконструкция трансплантированных нейральных клеток-предшественников в срезе спинного мозга. Масштаб установлен.

При правильном выполнении данный метод может быть реализован в течение двух недель после его разработки. Теперь эта методика открывает перед исследователями в области клеточной биологии возможности для изучения миграции нейрогенных клеток в 2D- и 3D-системах культивирования в ответ на воздействие электрического поля.