Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

Общая цель данной процедуры заключается в прямой визуализации микрорегиональной гипоксии тканей коры головного мозга мыши in vivo. Это достигается путем предварительного создания открытого краниального окна у мыши под наркозом. Затем внутривенно вводится флуоресцентный краситель для маркировки церебральных кровеносных сосудов.

Наконец, проводится одновременная фотонная визуализация собственной флуоресценции NADH и флуоресцентно меченой микроциркуляторного русла коры. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие функциональную гипоксию в микрообластях паренхимы головного мозга посредством визуализации присутствия восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида. Основным преимуществом этого метода перед существующими, такими как электроды Кларка, является высокое пространственное разрешение при большом поле зрения, а также меньшая инвазивность.

Этот метод можно реализовать на стандартной системе с двумя фотодетекторами и двумя флуоресцентными каналами. Здравствуйте, я Стив Херст, профессор и заведующий кафедрой микробиологии и иммунологии Университета Рочестера. Процедуру сегодня будут демонстрировать Анита Сон из лаборатории доктора Кишки, а также Оксана Полка, старший научный сотрудник моей лаборатории. Доктор Кишка, разработавший метод визуализации NADH, не может присутствовать сегодня, так как недавно переехал в Германию. Подготовив операционное поле с помощью необходимых инструментов, которые были автоклавированы или продезинфицированы 70% ethanol, и проведя анестезию мыши 5% isof fluorine, поместите животное на нагревательную подложку и наложите лицевую маску для подачи 1,3–1,5% isof fluorine в воздухе.

Проверьте уровень анестезии, сжав хвост животного. Затем введите ректальный зонд и непрерывно измеряйте температуру тела животного на протяжении всей процедуры. Нанесите гель для искусственных слез на глаза мыши, чтобы предотвратить их пересыхание.

Затем удалите шерсть с головы и обоих бедер; нанесите депиляционный крем на бедро на две минуты, чтобы удалить оставшиеся волоски (бедро будет использоваться для оксиметрии). В завершение продезинфицируйте кожу головы, используя 10% раствор повидон-йода и 70% этанол. Для создания краниального окна сделайте надрез ножницами на расстоянии пяти миллиметров от черепа.

Сделайте надрез на коже головы и продвиньтесь на один сантиметр. Раздвиньте кожу в стороны, чтобы обнажить череп. Удалите мембраны с поверхности черепа. Нанесите 10% раствор хлорида железа.

Удалите излишки раствора и аккуратно снимите мембраны, соскребая их под углом 45 градусов. Используя пинцет номер пять и диссекционный микроскоп, определите интересующую область. Нанесите тонкий слой быстросохнущего клея по краям окна головной пластины.

Расположите головную пластину таким образом, чтобы интересующая область была видна в окне, и слегка прижмите её. Нанесите небольшое количество стоматологического цемента для быстрой полимеризации клея. Удерживайте в течение 10 секунд, пока клей полимеризуется.

Нанесите небольшое количество быстросохнущего клея по краям окна, чтобы герметизировать головную пластину и череп. Затем прикрутите головную пластину к держателю животного под диссекционным микроскопом. Используйте набор из двух микроторсионных сверл, настроенных на 6, 000 RPM, и сверло IRF 0 0 5.

Удалите весь излишек клея с черепа и с головной пластины. Затем установите скорость сверления на 1000 RPM и начните сверлить череп, вырезая круг диаметром около 5 мм внутри окна головной пластины. Используйте легкие размашистые движения, как если бы вы рисовали очень мягким карандашом.

Каждые 20–30 секунд прекращайте сверление и используйте сжатый воздух для удаления костной пыли. По мере сверления вокруг сохранившейся части черепа в центре образуется желобок. Будьте осторожны, чтобы не проколоть тонкую кость черепа, и следите за тем, чтобы толщина этого желобка была равномерной.

Кроме того, будьте предельно осторожны вблизи крупных кровеносных сосудов. Их нельзя повреждать и, по возможности, даже затрагивать. Одной ветвью пинцета приподнимите кость в центре окна и нанесите каплю искусственной спинномозговой жидкости на окно. Углом салфетки Kim wipe аккуратно удалите искусственную спинномозговую жидкость, протирая под углом 45 градусов.

Пункт пять, пинцет. Найдите участок поврежденной твердой мозговой оболочки вдоль края окна и приподнимите ее, чтобы удалить. При возникновении кровотечения нанесите каплю искусственной спинномозговой жидкости и подождите две-три минуты до остановки незначительного кровотечения.

Затем приготовьте 10 миллилитров 0,07% низкоплавящегого агароза, растворенного в искусственной спинномозговой жидкости. Доведите расплавленный агароз до температуры тела. Удалите излишки искусственной спинномозговой жидкости с поверхности мозга.

Нанесите аэрозоль в окно и накройте его предметным стеклом. Затем осторожно прижмите стекло, чтобы обеспечить контакт между стеклом и головкой планшета, и подождите от 10 до 20 секунд до затвердевания аэрозоля. С помощью пинцета и мягкой салфетки удалите излишки аэрозоля с предметного стекла.

Нанесите небольшое количество быстросохнущего клея вокруг стекла, чтобы приклеить его к головной пластине. Затем нанесите небольшое количество стоматологического цемента для закрепления клея перед введением в бедренную вену. Частично переверните животное, чтобы открыть внутреннюю сторону левого бедра.

Зафиксируйте животное с помощью ленты. В таком положении обработайте кожу антисептическим скрабом, а затем 100% этанолом. Затем сделайте разрез вдоль медиальной поверхности бедра от колена до лобкового симфиза.

При необходимости раздвиньте мягкие ткани методом тупой диссекции. Наберите в шприц объемом 1 мл 130 µL Texas red. Установите новую иглу калибра 30G и осторожно согните ее под углом 30 градусов, удерживая срез иглы вверх.

Под диссекционным микроскопом наполните иглу раствором Texas Red, введите иглу в бедренную вену и введите 100 µL Texas red. Извлеките иглу и слегка прижмите вену марлей, чтобы остановить кровотечение. Зашейте кожу швом 4-0 для последующего непрерывного мониторинга насыщения крови кислородом.

Поместите датчик оксиметра на правое бедро, с которого предварительно была удалена шерсть. Чтобы начать визуализацию, перенесите хирургически подготовленную мышь на предметный столик микроскопа. Сделайте первоначальный снимок области краниального окна, используя освещение в светлом поле при четырехкратном увеличении; этот снимок будет служить опорной картой для регистрации при большем увеличении для анализа фотонных анизотропий.

Увеличьте интересующую область с помощью 10-кратного увеличения. Выберите интересующую область в слоях коры. Нажмите один или два раза, чтобы начать запись временного ряда.

Для повышения качества изображения мы рекомендуем использовать усреднение по трем-пяти кадрам. Затем вызовите гипоксемию, добавив 50% nitrogen в воздух, которым дышит животное. Это снизит уровень кислорода до 10%. Подтвердите развитие гипоксемии, контролируя данные оксиметра.

Продолжайте запись временного ряда в течение примерно 30 секунд во время гипоксемии и после восстановления нормального уровня кислорода. Соберите данные для расчета распределения кислорода путем обнаружения, измерения и количественной оценки площади гипоксических и оксигенированных тканевых цилиндров вокруг кровеносных сосудов. Для определения радиуса тканевого цилиндра R измерьте расстояние от центра кровеносного сосуда до границы, при которой обнаруживается высокая флуоресценция NADH.

Методы обработки данных приведены в письменном протоколе. На этом рисунке представлены одновременные изображения NADH и географические карты, полученные при видеозаписи во время транзиторной гипоксемии, когда концентрация вдыхаемого кислорода была снижена с 21% до 10% в течение трех минут. Данный уровень экспериментально индуцированной гипоксемии достаточен для развития тяжелой гипоксии в коре головного мозга.

Гипоксия привела к увеличению флуоресценции NADH, первоначально показанной зеленым цветом в областях, наиболее удаленных от артериального кровоснабжения. Обратите внимание на четкие границы NADH в тканях, которые представляют собой наблюдаемые границы диффузии кислорода из кортикальной микроциркуляции, показанной красным цветом. Здесь представлено совмещенное изображение флуоресцентно помеченных микрососудов коры красным цветом и собственной флуоресценции NADH серого вещества коры зеленым цветом; распределение интенсивности флуоресценции NADH носит бинарный характер.

Присутствуют области с равномерно низкой флуоресценцией NADH и области с равномерно высокой флуоресценцией NADH. Желтые линии обозначают границы тканей между областями с низкой и высокой флуоресценцией NADH. Эти границы тканей демонстрируют пространственную связь с расположенными рядом микрососудами.

Эта взаимосвязь определяется диффузией кислорода из микрососудов в ткань. В некоторых случаях цилиндрический характер или цилиндр ткани CRO этих тканевых границ может быть определен непосредственно, что обозначено синими линиями. В данном случае тканевая граница имеет круговую форму с концентрическим центральным кровеносным сосудом после освоения метода.

При правильном выполнении эта методика занимает 1,5 часа. Во время проведения процедуры важно не забыть приклеить покровное стекло к металлической пластине, чтобы предотвратить вертикальное смещение кортикальной поверхности вследствие отека. После выполнения данной процедуры можно провести дополнительные анализы, например, измерения функциональной гиперемии, с целью изучения таких вопросов, как взаимосвязь между гипоксией тканей и цереброваскулярным сопряжением.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как визуализировать микрорегиональную гипоксию тканей в коре головного мозга мыши.