Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

Общая цель данной процедуры заключается в изучении влияния механической нагрузки на протеолитическое расщепление одиночных белков высокопараллельным и экономически эффективным способом. В данной демонстрации исследуется расщепление коллагена матриксной металлопротеиназе-1: на первом этапе коллагеновые триммеры прикрепляются к стеклянному покровному стеклу проточной кюветы, после чего к отдельным молекулам коллагена прикрепляются магнитные бусины микронного размера. На втором этапе проточная кювета устанавливается в аппарат для магнитных пинцетов, после чего проверяется удаление с поверхности покровного стекла бусин, прикрепившихся неспецифически.

Затем протеаза добавляется в проточные ячейки. Заключительный этап заключается в определении скорости протеолиза путем мониторинга отсоединения микросфер в режиме реального времени. Измеряя скорость отсоединения микросфер при различных концентрациях протеазы и значениях силы, можно рассчитать стандартные зоологические кинетические параметры, используя минимальные количества субстрата и протеазы.

Кроме того, данный метод предоставляет уникальную информацию о влиянии механической силы на скорость протеолиза и на структурные изменения субстратного белка, сопровождающие расщепление. Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими подходами, такими как оптические T-трейсы и атомно-силовая микроскопия, является его высокая производительность и экономическая эффективность. Хотя данный метод позволяет изучить влияние эффективной силы на протеолитическое расщепление одиночных белков, используемое оборудование и методики могут быть применены к широкому спектру биофизических задач, включая изучение влияния силы на фолдинг и конформацию белков.

Начните подготовку проточной кюветы с очистки покровных стекол с помощью соникации. Поместите покровные стекла в небольшой подходящий по размеру стеклянный контейнер, который помещается в ультразвуковую ванну. Заполните контейнер изопропанолом и подвергните соникации в ультразвуковой ванне в течение 20 минут, затем удалите изопропанол и промойте покровные стекла большим количеством деионизированной воды.

Заполните контейнер водой и подвергните образцы воздействию ультразвука в течение 20 минут. После соникации высушите покровные стекла струей фильтрованного чистого воздуха. Осмотрите покровные стекла и используйте только те, на которых нет пятен.

Осторожно прокалите покровные стекла в течение нескольких секунд, чтобы очистить их от остатков пыли и влаги, пронеся их через пламя газовой горелки Бунзена; при этом следите за тем, чтобы стекла не деформировались от избыточного нагрева. Данный этап позволяет удалить остаточные загрязнения с поверхности.

Затем с помощью двустороннего скотча соедините два покровного стекла. Отрезав полоску скотча длиной примерно три сантиметра и шириной 0,3 сантиметра, прикрепите её к покровному стеклу размером 22 на 40 миллиметров так, чтобы посередине остался зазор шириной 1,6 сантиметра. С помощью наконечника дозатора аккуратно прижмите покровное стекло, чтобы убедиться в надежном приклеивании скотча.

Установка с магнитным пинцетом была сконструирована в данной лаборатории с использованием алюминиевого L-образного кронштейна с отверстием диаметром 1 мм; установка смонтирована на вертикальном Z-трансляторе для регулировки высоты пинцета. Для создания градиента магнитного поля к кронштейну по обе стороны от отверстия были прикреплены два постоянных редкоземельных магнита. Правильная калибровка магнитной ловушки имеет определяющее значение для данной процедуры.

Для обеспечения успешного результата мы используем два различных метода, описанных в данном разделе. Для калибровки магнитной ловушки используйте предварительно подготовленную ДНК бактериофага Lambda, меченную на 5'- и 3'-концах биотином и доксигеном, как описано в письменном протоколе. Чтобы закрепить ДНК в проточной ячейке, сначала заполните ячейку раствором антител к доксигену и дайте антителам адсорбироваться на стеклянной поверхности в течение 15 минут.

Затем, чтобы предотвратить неспецифическое связывание ДНК, обработайте поверхность проточной кюветы, добавив в нее раствор BSA. Обратите внимание, что на этом этапе блокировки и на всех последующих этапах объем добавляемого в проточную кювету реагента должен быть как минимум в два раза больше объема самой кюветы, который в данной демонстрации составляет 75 µL. Инкубируйте проточную кювету при комнатной температуре в течение 45 минут.

После повторения этого шага добавьте 50 pico molar функционализированной lambda DNA и дайте ей прикрепиться к покровному стеклу в течение 15 минут, затем удалите избыток DNA, промыв один раз XPBS. Наконец, добавьте суперпарамагнитные частицы, покрытые стрептавидином, и дайте им прикрепиться к иммобилизованной DNA в течение 15 минут. В данной демонстрации используются частицы размером 2.8 micrometer.

Смойте избыток микросфер одним объемом XPBS. Затем проведите калибровку магнитных пинцетов, переместив постоянные магниты в положение, удаленное от поверхности образца. После этого поместите подготовленную проточную кювету в микроскоп.

Переместите постоянные магниты в положение над проточной кюветой. Выберите фокальную плоскость для функционализированных частиц с Lambda DNA, наведя фокус на частицы вдали от обеих стеклянных поверхностей. Правильной фокальной плоскостью является та, при которой искомые частицы имеют яркий центр.

Запишите видео движения микросфер с частотой не менее 80 Гц на протяжении 500 кадров. Перемещайте магнит ближе к поверхности образца и записывайте видео движения микросфер в каждом положении. Для расстояний более 5 мм перемещайте магнит с шагом 1 мм для интервалов от 1 до 5 мм.

Перемещайте с шагом 0,5 millimeter для расстояний менее одного миллиметра и с шагом 0,25 millimeter в остальных случаях. Для каждого набора данных отслеживайте центр бусин, используя двумерную гауссову аппроксимацию. Рассчитайте силу по броуновским флуктуациям, как описано в письменной процедуре. Подтвердите точность определения сил, проверив расчет силы с помощью линейной аппроксимации спектра мощности.

Чтобы определить частоту среза, взаимосвязь между приложенной силой и частотой среза можно найти в тексте перед прикреплением коллагенового пептида к проточным ячейкам; экспрессируйте и очистите коллагеновый пептид и белки MMP-1. Начните с добавления раствора антител anti-MIC в проточную ячейку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы антитела anti-MIC прикрепились к поверхности проточной ячейки; блокируйте проточную ячейку для предотвращения неспецифического связывания белков, используя BSA в концентрации 5 mg/mL. Добавьте 150 pM коллагенового пептида и дайте ему прикрепиться к антителу через M-тег в течение 45 минут.

Перед добавлением бусин размером 2,8 мкм в проточную кювету удалите излишки коллагена, промыв её буфером PBS. Бусины следует отделить от раствора бусин с помощью сильных магнитов, а затем ресуспендировать в PBS. Эту процедуру необходимо повторить три раза.

Этот этап необходим для связывания микросфер размером 2,8 мкм с иммобилизованным на поверхности коллагеновым пептидом. Затем добавьте суперпарамагнитные микросферы, покрытые стрептавидином, и оставьте их на 45 минут для прикрепления к молекулам коллагена. После того как проточная ячейка будет собрана с коллагеновым пептидом и магнитными микросферами, получите изображение проточной ячейки в магнитной ловушке.

При воздействии низкой силы часть бусин может оказаться слабо связанной, адгезировав к поверхности неспецифически. Приложение умеренной силы обеспечивает высвобождение таких бусин. Добавьте активированный фермент в проточную кювету.

В данном случае MMP1 предварительно активировали путем добавления 3,5 мМ PMA и инкубировали при 37 °C в течение трех часов. Сразу после повторного введения проточной кюветы в аппарат с магнитными пинцетами запишите видео, охватывающее несколько полей зрения, что обычно позволяет получить несколько сотен прикрепленных бусин. Это измерение соответствует моменту времени t = 0.

Повторяйте процедуру записи нескольких полей зрения через регулярные интервалы времени до тех пор, пока все частицы не отделятся или пока не станет незаметно дальнейшего протеолиза. Магнитные пинцеты были откалиброваны для частиц размером 1 мкм и 2,8 мкм. Используя как амплитуду наблюдаемых броуновских флуктуаций, так и расчет частоты спада при различных положениях магнита в экспериментах по принудительному протеолизу, можно построить график нормализованного количества оставшихся частиц в зависимости от времени для определения скорости протеолиза.

Этот процесс можно повторить для различных концентраций фермента и величин приложенной силы. Скорость протеолиза зависит от приложенной силы. Скорость протеолиза определяли при 1 pN, 6,2 pN и 13 pN.

Доля развернутых бусинок при времени более 15 минут остается примерно постоянной и составляет 0,25 в разных экспериментах. В нашем случае данный анализ позволил измерить каталитическую эффективность MMP1 в зависимости от приложенной силы. Анализ данных показал, что перед протеолизом тройная спираль коллагена должна локально развернуться.

После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает от пяти до шести часов. Важно помнить, что для достижения хорошей статистической значимости данных необходимо наличие как минимум 30–50 микросфер в каждом поле зрения. Не забывайте, что PMA может быть крайне опасен, поэтому при проведении данного эксперимента следует всегда соблюдать меры предосторожности, используя перчатки, лабораторные халаты и защитные маски.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как измерять влияние силы на протеолитическое расщепление одиночных белков с помощью магнитных пинцетов. Магнитные пинцеты являются отличным инструментом для изучения биофизических экспериментов с отдельными молекулами. Данный метод может быть применен и к другим комбинациям протеаз и субстратов.

Кроме того, аналогичные методы могут быть использованы для изучения структурной динамики белков, а также для исследования других белков, которые связывают или модифицируют РНК и/или ДНК.