Моделирование и обработка изображений 3-мерная коллективной Вторжение сотовый

Данная экспериментальная система предназначена для характеристики вклада специфических белков в процесс инвазии. Начните с ретровирусной трансдукции клеток соответствующим флуоресцентным белком. Также создайте трехмерный матрикс из белка matrigel в инсертах transwell и подготовьте клеточную суспензию с подходящим разведением.

Используя систему Transwell с Matrigel, измерьте ответ трансмиграции на хемоаттрактант при воздействии исследуемых препаратов или методов лечения, затем перейдите к визуализации и анализу инвазии клеток с помощью конфокальной микроскопии. В конечном итоге полученные результаты позволят определить степень и способ инвазии клеток в трехмерный белковый матрикс. Преимущество данного метода перед существующими, такими как традиционный анализ инвазии в камерах Transwell, заключается в возможности получения как количественных, так и качественных данных об инвазии клеток в трехмерный белковый матрикс.

Мой коллега, Дайан Крейтон, продемонстрирует метод культивирования клеток для упаковки ретровирусов в среде DMEM с 10% FBS в течение 48 часов. Проведите трансфекцию клеток ретровирусной ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Инкубируйте в течение 24 часов, дважды промойте лунки средой, затем добавьте по 1,5 мл 10% FBS-DMEM в каждую лунку и инкубируйте в течение 48 часов для сбора упакованного ретровируса.

Перенесите среду для культивирования тканей в микроцентрифужные пробирки объемом два миллилитра, центрифугируйте для осаждения клеток и соберите супернатант в чистую пробирку. Храните данный сток ретровируса при температуре минус 80 °C. Чтобы провести ретровирусную трансдукцию клеток, удалите среду из культуры после ночного инкубирования и добавьте один миллилитр стока ретровируса с добавлением poly green.

После шестичасовой инкубации добавьте в лунку два миллилитра 10% F-B-S-D-M-E-M и поместите планшеты в инкубатор при температуре 37 °C. В течение ночи обновите среду, а через 24 часа добавьте соответствующую селективную среду. После достижения конфлюэнтности соберите клетки и проведите сортировку по флуоресценции, используя нетрансдуцированные клетки в качестве контроля. Соберите клетки с уровнем флуоресценции выше, чем у нетрансдуцированных клеток, и заморозьте аликвоты при температуре -80 °C для последующего использования.

Этот метод основан на экспрессии флуоресцентных белков для визуализации и позволяет определить вклад отдельных клеток. Тщательно разморозьте Matrigel на льду, затем разведите его в соотношении один к одному в ледяном PBS. Теперь вставьте непокрытые трансвелл-вставки в 24-луночный планшет для культивирования тканей.

Затем осторожно перенесите пипеткой 100 µL разведенного Matrigel в лунки и дайте ему затвердеть при 37 °C. Тем временем подготовьте суспензии клеток с флуоресцентной меткой в их стандартной ростовой среде. После затвердевания Matrigel переверните трансвеллы и нанесите пипеткой 100 µL клеточной суспензии на нижнюю сторону фильтра, обращенную к выходу.

Осторожно накройте трансвеллы дном 24-луночного планшета для культивирования тканей так, чтобы дно касалось каждой капли клеточной суспензии. Инкубируйте планшет в перевернутом состоянии в течение четырех часов для обеспечения прикрепления клеток. Затем переверните планшет в исходное положение и промойте каждый трансвелл, дважды погрузив его в 1 mL безсывороточной среды.

Затем поместите трансвелл в третью лунку, содержащую любые препараты или реагенты для обработки. Осторожно внесите пипеткой 100 µL среды, содержащей хемоаттрактант, в трансвелл поверх затвердевшей смеси Matrigel и PBS. Инкубируйте в течение трех-пяти дней при 37 °C в атмосфере с 5% CO2 для визуализации нефлуоресцентных клеток, инвазировавших в Matrigel.

Поместите трансвеллы в новые 24-луночные планшеты и перенесите пипеткой 1 мл раствора Calcein AM с концентрацией 4 мкМ на каждый слой Matrigel, позволяя раствору стекать по краям, чтобы окрашивание происходило как сверху, так и снизу. Инкубируйте в течение одного часа при 37 °C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. Затем проведите визуализацию с помощью конфокальной микроскопии.

Данный первый метод окрашивания прижизненного состояния позволяет визуализировать способы инвазии. Перенесите каждый трансвелл в новый 24-луночный планшет, налейте 1 мл 4% параформальдегида с 0,2% Triton X 100 и инкубируйте при комнатной температуре в течение получаса. После трехкратного промывания 1 мл PBS добавьте RNase A в концентрации 0,01 мг/мл на 30 минут, затем дважды промойте PBS для визуализации.

Разведите пропидий иодид в PBS и выдержите при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Промойте трижды с помощью PBS. На данном этапе окрашенные пропидий иодидом трансвеллы можно хранить при комнатной температуре в темноте не менее одного месяца.

Второй метод окрашивания клеток требует фиксации, но позволяет более быстро количественно оценить инвазию. Используя инвертированный конфокальный микроскоп, поместите трансвелл с небольшим количеством остаточного PBS на большой покровный стеклo над объективом с 20-кратным увеличением без иммерсии и снимите оптические срезы через каждые 10–15 мкм от дна пробки из Matrigel. Количественно определите степень инвазии, используя отдельные оптические срезы. Также создайте трехмерные объекты с помощью подходящего программного обеспечения, такого как Velocity, на основе данной серии оптических срезов; клетки были окрашены calcium AM.

Как и ожидалось, количество клеток, мигрирующих вверх через фильтр, уменьшается по мере увеличения расстояния. Эту инвазию можно количественно оценить. Трехмерные реконструкции клеточной инвазии позволяют визуально представить характер этого процесса.

Если клетки помечены экспрессией флуоресцентных белков, то положение клеток каждого цвета можно визуализировать на трехмерных реконструкциях, как показано на данном виде сбоку. Кроме того, срезы через реконструкцию могут дать представление о молекулярных механизмах. После просмотра этого видео вы должны получить четкое понимание того, как использовать данный анализ инвазии клеток для получения более подробной информации о процессе уклонения, чем это возможно при использовании стандартных методов.