Функциональной визуализации кальция в развивающихся Корковая сетей

Общая цель данного видео — продемонстрировать способ измерения сетевой активности в развивающихся срезах коры головного мозга с использованием кальций-чувствительного флуоресцентного индикатора. Срезы мозга DY готовят из развивающейся энтеральной коры молодого мышонка. Как нейроны, так и астроциты нагружают кальций-зависимыми маркерами.

Изменения флуоресценции кальций-зависимых красителей отражают изменения клеточной активности. Нейрональные и ненейрональные клетки, включая астроциты, микроглию и эндотелиальные клетки, могут быть окрашены с помощью специфических маркерных красителей. Активность кортикальной сети регистрируется с помощью интервальной многофотонной визуализации; клетки в сети обнаруживаются путем создания 3D-стека изображений в исследуемой области.

Затем можно проанализировать изменения клеточной флуоресценции в нескольких клетках, чтобы определить активность развивающейся сети коры. Характерным паттерном активности в развивающейся нервной системе является спонтанная синхронизированная сетевая активность. Синхронизированная активность наблюдалась во многих различных развивающихся нейронных областях, включая интактную кору спинного мозга и препараты диссоциированных нейронных культур в периоды спонтанной активности нейронов, которые деполяризуются для генерации одиночных спайков или вспышек потенциалов действия, активирующих многие ионные каналы, включая потенциалзависимые кальциевые каналы, что приводит к притоку кальция.

Высокосинхронизированная активность локальных сетей измерялась с помощью полевых электродов или многоэлектродных матриц. Эти методы обеспечивают высокую частоту временной дискретизации, но обладают более низким пространственным разрешением из-за интегрированного считывания активности клеток. Разрешение нейронной активности на уровне одиночных клеток возможно при использовании метода пэч-кламп электрофизиологии одиночных нейронов для измерения частоты импульсации.

Однако возможность проведения измерений в сети ограничена количеством одновременно зарегистрированных нейронов, которое обычно составляет всего один или два. Использование кальций-зависимых флуоресцентных индикаторных красителей позволило измерять синхронизированную активность во всей сети клеток. Этот метод обеспечивает как высокое пространственное разрешение, так и достаточное временное сэмплирование для регистрации спонтанной активности развивающейся сети.

Флуоресцентные кальций-чувствительные индикаторы, такие как эфир URA 2:00 AM, содержат карбоксильные группы, способные связывать ионы кальция. Эти флуоресцентные красители активируются световыми волнами определенной длины с помощью однофотонной или двухфотонной микроскопии. Количество фотонов, излучаемых красителем, временно изменяется при связывании с кальцием.

Это изменение количества фотонов или флуоресценции регистрируется как сигнал delta FF и соответствует изменению уровня кальция в нейроне. Измерение изменений в кальций-чувствительных индикаторах является полезным показателем паттернов сетевой активности в развивающихся клетках. Здравствуйте, я Рианна Морти, а меня зовут Джули Эбботс.

Мы представляем кафедру интерпретационной нейрофизиологии Амстердамского университета. Мы используем кальциевый имиджинг для изучения функциональной активности в развивающейся ткани коры головного мозга мыши с помощью кальций-чувствительных индикаторов при мультифокальной визуализации. Цель этого короткого фильма — продемонстрировать, как эти методы могут быть использованы для измерения паттернов как спонтанной, так и вызванной активности в развивающихся сетях нервной системы.

Быстро извлеките мозг из черепа молодого мыши, чтобы минимизировать повреждение нейронных связей. Проведите диссекцию мозга в ледяном растворе для срезов. Раствор для срезов содержит холинохлорид вместо натрия, который обычно используется в A TSF для регистрации нейронной активности.

В данных экспериментах мы готовим срезы мозга из энтеральной коры развивающегося мозга мыши. Поместите кусочек фильтровальной бумаги на чашку Петри и смочите его несколькими миллилитрами A TSF. Перенесите мозг на фильтровальную бумагу.

Разделите полушария пополам с помощью одного лезвия бритвы. Разъедините два полушария. Поместите одно из них обратно в охлажденный раствор для срезов вместе с оставшимся полушарием.

Удалите мозжечок с помощью лезвия бритвы. Положите одно полушарие на его срединную линию и сделайте разрез примерно на один миллиметр от дорсальной поверхности, слегка наклонив лезвие в сторону рострального конца. Переверните мозг.

Очистите свежесрезанную поверхность с помощью ватного тампона и металлического шпателя. Перенесите мозг на металлический блок для резки. Осторожно сдвиньте мозг со шпателя с помощью ватного тампона на заклеенную поверхность.

Срезы мозга толщиной 300 Micrometer делают при скоростях резания и частоте движения лезвия, которые обычно ниже, чем те, что используются для более зрелых тканей. После нарезки каждый срез переносят с помощью стеклянной пипетки в камеру для удержания, содержащую оксигенированный A TSF при комнатной температуре. A CSF содержит более высокое соотношение магния к кальцию, чем раствор A CSF.

Срезы, предназначенные для записи, оставляют на один час для восстановления. Для загрузки клеток кальций-зависимым индикатором или специфическим клеточным маркером срезы необходимо перенести в камеру для проведения процедуры окрашивания. Несмотря на доступность коммерческих камер, такую камеру можно легко собрать из стандартного лабораторного оборудования при минимальных затратах.

Для изготовления камеры для окрашивания вам потребуется следующее базовое лабораторное оборудование: две пластиковые чашки Петри, шприц объемом 10 миллилитров, отрезок силиконовой трубки, вставка для культуры клеток с полупроницаемой мембраной, суперклей, три маленьких соединителя для трубок и тонкая игла.

Проденьте отрезок силиконовой трубки через отверстие и сформируйте петлю внутри маленького планшета. Используйте суперклей, чтобы герметизировать открытый конец трубки. Затем приклейте оставшуюся часть трубки к внутренней стенке маленькой чашки Петри.

Поместите маленькую чашку Петри в центр большой и приклейте её. Возьмите оставшийся конец силиконовой трубки и проденьте его через маленькое отверстие в боковой стенке чашки Петри. С помощью тонкой иглы сделайте небольшие отверстия в силиконовой трубке внутри чашки Петри.

Сделайте отверстия через равные промежутки для равномерного слияния гаспера. Возьмите лунку для культивирования клеток с полупроницаемой мембраной, используя нагретый скальпель. Срежьте верхние один сантиметр лунки, чтобы получилось неглубокое блюдце для удержания срезов во время инкубации.

Поместите плоскую чашку в центр малой чашки, окруженной пористой кремниевой трубкой. Проделайте в крышке большой чашки отверстие диаметром примерно от 0,5 до 1 см. Возьмите пластический шприц объемом 10 мл, используя нагретый скальпель.

Сделайте косой срез, чтобы удалить конец шприца. Нанесите суперклей на срезанную поверхность трубки шприца. Приклейте её непосредственно поверх отверстия в крышке большой чашки Петри.

Прикрепите коннектор для трубки к концу наконечника шприца. Поместите плоскую чашку в центр маленькой чашки Петри, убедившись, что пористая трубка для газа расположена по периметру чашки. Затем эта трубка подключается к источнику карбогенного газа для оксигенации срезов.

Во время инкубации закройте большую чашку крышкой, которая также напрямую подключена к источнику газа через наконечник шприца. Это обеспечит подачу CO₂ и газа над срезами в процессе инкубации, чтобы предотвратить выцветание красителя. Все процедуры проводятся при минимальном освещении, а краситель и срезы содержатся в темноте.

Заполните камеру окрашивания примерно полутора миллилитрами A TSF из держателя среза. Поместите внутрь интерфейсную камеру и добавьте еще один миллилитр A TSF. Важно поддерживать достаточный приток кислорода для сохранения жизнеспособности ткани и качественной загрузки среза.

Окрашивание проводится при температуре около 35 °C для облегчения проникновения красителя в нейроны во время нагрева камеры для окрашивания. Приготовьте индикаторный краситель для fira 2:00 AM Ester. Добавьте 9 µL DMSO и 1 µL оновой кислоты в виалу с 50 µg вещества.

DMSO и олеиновая кислота. Выступают в качестве агентов проницаемости, позволяя красителю проникать через липидную мембрану. Перемешивайте флакон на вортексе в течение 15 минут, чтобы убедиться, что краситель полностью растворился.

Для окрашивания перенесите каждый срез в интерфейс. Поместите их в камеру для окрашивания. Нанесите краситель непосредственно на интересующую область над срезами и закройте крышку камеры для окрашивания.

Оставьте срезы инкубироваться в темноте от 20 до 40 минут в зависимости от возраста использованной мыши. После инкубации перенесите срезы обратно в держатель для срезов, чтобы смыть остатки избытка красителя. Протоколы окрашивания для кальциевого имиджинга также могут быть адаптированы для более старых тканей.

Для этого требуется дополнительный этап предварительной инкубации. Перенесите старые срезы в неглубокий контейнер для предварительной инкубации, заполненный 3 mL CSF и 8 µL раствора crema four в концентрации 0.5%. Нагревайте при 35 °C в течение трех минут. Затем перенесите срезы на границу раздела фаз, поместите в камеру окрашивания и следуйте стандартным процедурам окрашивания.

Также возможно окрашивание этих срезов на ненейрональные клетки, а именно астроциты, микроглию и эндотелиальные клетки. Для окрашивания астроцитов на сульфурдомин можно использовать сульфуррумин 1 0 1. Приготовьте раствор с концентрацией 10 µM и нанесите фиолетовый краситель пипеткой на интересующую область срезов.

Инкубируйте в течение 15 минут. Перенесите срезы обратно в камеру для выдерживания, чтобы удалить излишки красителя. Конъюгат FSE с томатным лектином может использоваться для окрашивания микроглии и эндотелиальных клеток.

Приготовьте раствор лектина томата в концентрации 20 мкг/мл. Нанесите краситель на интересующую область срезов. Оставьте срезы для инкубации на 45 минут.

Затем снова перенесите срезы в камеру для хранения. При проведении визуализации срезы должны быть стабильно зафиксированы под микроскопом. Обычно для прижатия ткани используется металлическая прижимная пластина (арфа), однако она может неравномерно деформировать поверхность среза, что приводит к ограничению области фокусировки при визуализации, чего следует избегать.

Эти срезы фиксируют в регистрирующей камере с помощью полиэтилена или раствора PEI. PEI представляет собой полимер, используемый для улучшения прикрепления клеток к поверхности в течение как минимум одного часа. Перед помещением срезов в регистрирующие камеры заполните их несколькими миллилитрами раствора PEI, чтобы покрыть дно камеры.

Сначала промойте камеру дистиллированной водой, чтобы удалить PEI, а затем используйте раствор A CSF. Перенесите срез в регистрирующую камеру и удалите излишки раствора A CSF. С помощью тонкой кисти расположите срез в центре камеры.

Удалите весь остаточный A CSF с помощью небольших кусочков абсорбирующей фильтровальной бумаги. Убедитесь, что по краям среза больше нет A CSF. В завершение аккуратно нанесите 0.5 mL A CSF на срез, стараясь не сместить его в камере.

Поместите камеры в большой контейнер с оксигенированным интерфейсом и оставьте еще на один час в темноте. Изменения красителей — кальций-чувствительных индикаторов — можно регистрировать с помощью одно- или двухфотонной микроскопии. Для двухфотонной визуализации наших нейронных сетей мы используем титан-сапфировый лазер, сопряженный с микроскопом Olympus.

Кроме того, для повышения частоты сканирования кадров мы используем систему трим-скопа L Vision biotech с камерой EM CCD hammer MATSU. Поместите камеру со срезом под микроскоп при стабильном потоке оксигенированного A-T-S-F-A-T-S-F, содержащего 1.6 millimolar кальция и 1.5 millimolar магния, нагретого в установке до приблизительно 30 °C с использованием белого света.

Найдите интересующую область на срезе и сфокусируйтесь на поверхности. Выключите свет и закройте дверцу записывающего шкафа, чтобы снизить уровень фонового освещения.

Для записи и анализа изображений доступно множество различных коммерческих или открытых программных пакетов. В нашей лаборатории для сбора данных мы используем программное обеспечение Inspector от Lavis Biotech. Чтобы начать получение изображений, выберите режим ПЗС-камеры для детекции. Установите длину волны, соответствующую вашему индикатору.

Для fira 2:00 AM Ester мы установили длину волны возбуждения 820 нанометров в программном обеспечении трим-микроскопа. Выберите режим сканирования 64 B. Подберите оптимальный размер поля зрения и разрешение пикселей для интересующей вас области.

Выберите подходящую частоту кадров и, при необходимости, вращение пикселей для получения образцов вашего изображения. Откройте затвор лазера для непрерывного получения изображений. Используйте режим непрерывной съемки.

Отрегулируйте усиление и интенсивность лазера, затем сфокусируйтесь на нейронной сети, которую необходимо визуализировать. Остановите сканирование. В настройках таймлапса выберите частоту кадров и длительность последовательности.

После проведения таймлапс-визуализации выполните Z-стек изображений, захватывающий область 20 мкм выше и 20 мкм ниже с шагом в 1 мкм. Данный Z-стек используется для детектирования клеток в процессе анализа. Экспортируйте записанные файлы в виде стека изображений в формате TIFF.

В заключение мы продемонстрировали использование индикаторов кальция для измерения синхронной спонтанной сетевой активности в развивающейся коре головного мозга. Более подробную информацию о методологии и реагентах можно найти в листах с данными, прилагаемых к этому фильму, что позволит вам внедрить данную методику в вашей собственной лаборатории.