Метаболический Подтверждение пути и Discovery Через ¹³ C-маркировки протеиногенных Аминокислоты

Целью данного протокола является изучение бактериального метаболизма с помощью метаболомного анализа с использованием углерода 13. Для начала микробы выращивают в присутствии меченых углеродных субстратов, которые встраиваются в микробные белки. Затем микробы собирают, после чего проводят экстракцию, гидролиз и дериватизацию аминокислот.

Образцы вводят в газовый хроматограф с масс-спектрометром или ГХ-МС. Отслеживая пути перехода атомов между метаболитами в биохимической сети, можно определить функциональные метаболические пути, используемые микробом. Я Берт Бурла.

Представленный здесь метод может быть использован в дополнение к транскриптомике и протеомике для определения метаболических путей микроорганизмов. Мы использовали этот метод для исследования фотосинтезирующих микробов, таких как цианобактерии, на предмет миотрофного или гетеротрофного использования углерода. В данном видео мы будем использовать ANOTHE 5 1 1 42 в качестве модельного штамма, чтобы продемонстрировать использование меченных углеродных субстратов для поиска новых ферментативных функций.

Процедуру продемонстрируем я, li Yu и Chu Yang Fang. Начните выполнение данной процедуры с культивирования бактерий cyana thesei в немаркированной среде. Когда бактерии достигнут средней логарифмической фазы роста, инокулируйте 3% по объему в среду, меченную углеродом 13.

Затем, чтобы избежать попадания немаркированного углерода из исходной субкультуры инокулята в ту же маркированную среду в средней логарифмической фазе роста, при достижении бактериями Cy Thesei, маркированными углеродом 13, средней логарифмической фазы роста, соберите 10 мл путем центрифугирования. Ресуспендируйте осадок в 1,5 мл 6 М соляной кислоты и перенесите его в прозрачный стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой для газовой хроматографии (ГХ).

Закройте флаконы крышками и поместите их в печь при температуре 100 °C на 24 часа для гидролиза белков биомассы до аминокислот. Гидролиз гранул биомассы позволяет получить 16 из 20 общих аминокислот; после гидролиза перенесите раствор аминокислот в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл, затем центрифугируйте при 20 000 ×g в течение пяти минут. После гидролиза перенесите раствор аминокислот в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл, затем центрифугируйте при 20 000 ×g в течение пяти минут для осаждения твердых частиц.

После центрифугирования перенесите супернатанты в новые виалы для ГХ, чтобы удалить твердые частицы из раствора гидролиза и предотвратить их попадание в колонку ГХ. Затем аминокислоты подвергают дериватизации для придания им летучести, необходимой для разделения методом газовой хроматографии. Растворите высушенные образцы в 150 µL тетрагидрофурана (ТГФ) и 150 µL смеси N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамида.

Инкубируйте все образцы с реагентом для дериватизации ацетамид, T-B-D-M-S, в термостате при температуре от 65 до 80 °C в течение одного часа. Время от времени перемешивайте образцы на вортексе, чтобы убедиться, что метаболиты в виале полностью растворились. Центрифугируйте образцы при 20 000 ×g в течение 10 минут, после чего перенесите супернатант в новые виалы для ГХ.

Супернатант должен представлять собой прозрачный желтоватый раствор. Температурный режим ГХ следующий: выдержка при 150 °C в течение двух минут. Повышение температуры со скоростью 3 °C в минуту до 280 °C.

Повышайте температуру со скоростью 20 °C в минуту до 300 °C, затем выдерживайте при этой температуре в течение пяти минут. Затем для ГХ-колонки длиной 30 м установите задержку выхода растворителя (solvent delay) примерно на пять минут, а диапазон отношения массы к заряду — от 60 до 500. Проанализируйте образцы методом ГХ-МС, используя объем ввода 1 µL при коэффициенте деления потока от 1:5 до 1:10 и скорость потока газа-носителя гелия 1,2 mL/min в соответствии с программой анализа.

Проанализируйте данные ГХ-МС с помощью Microsoft Excel. Время удерживания в ГХ и уникальные пики отношения массы к заряду для каждой аминокислоты представлены на данном рисунке. T-B-D-M-S. Производные аминокислот обычно четко разделяются МС на два заряженных фрагмента: фрагмент M минус 57, который содержит всю аминокислоту, и фрагмент M минус 159, в котором отсутствует альфа-карбоксильная группа аминокислоты для лейцина и изолейцина.

Пик M минус 57 перекрывался другими масс-пиками фрагментов. N минус 15 может быть использован для анализа всего мечения аминокислот. Кроме того, группа F 3 0 2 часто обнаруживается в большинстве аминокислот и содержит только первую альфа-карбоксильную группу и вторые атомы углерода в остове аминокислоты.

Однако, поскольку этот пик Ms.Peak часто характеризуется высоким отношением шума к сигналу, использование F 3 0 2 не рекомендуется для количественного анализа метаболических потоков. Дериватизация аминокислот или центральных метаболитов приводит к внесению значительного количества природных изотопов, включая carbon 13, oxygen 18, silicon 29 и silicon 30. Шум измерений, вызванный природными изотопами в исходном масс-спектре или изотопном профиле, может быть скорректирован с помощью опубликованного программного обеспечения.

Конечные данные изотопного мечения представлены в виде массовых долей. Например, M0, M1, M2, M3 и M4 представляют фрагменты, содержащие от нуля до четырех атомов углерода, меченных изотопом углерода-13. В штамме 5 1 1 2 отсутствует фермент треонин-аммиак-лиаза, который катализирует превращение треонина в 2-кетобутират в типичном пути синтеза илеина.

Таким образом, чтобы выяснить путь изолейцина в этом организме, штамм Cyana Thesei 5 1 1 4 2 выращивали в среде ASP two с 54 мМ глицерина и анализировали с помощью GCMS, как описано в данном видео и показано здесь. Cyana Thesei 5 1 1 4 2 использует глицерин с меткой во втором положении в качестве основного источника углерода; мы обнаружили, что треонин и аланин, предшественником которых является пируват, имеют один меченый углерод, в то время как изолейцин был мечен тремя углеродами. Следовательно, синтез в Cyana Thesei 5 1 1 4 2 не может осуществляться через треониновый путь, используемый большинством организмов. С другой стороны, лейцин и изолейцин имеют идентичные паттерны мечения на основании фрагмента M минус 15 и фрагмента M минус 1 59.

Например, изотопные данные по N-15, содержащие нефрагментированные аминокислоты, показали идентичную маркировку для лейцина и изолейцина. Таким образом, лейцин и изолейцин должны синтезироваться из одних и тех же предшественников — пирувата и ацетил-КоА. Это наблюдение согласуется с переходом меченого углерода в цитрат-малатном пути синтеза изолейцина.

Данный метод может быть использован для исследования метаболизма широкого спектра микроорганизмов и после освоения может быть выполнен от начала до конца примерно за одну неделю.