Отображение молекулярной диффузии в плазме мембраны Несколько-Target трассировки (MTT)

Здравствуйте. В этом видео мы представляем полный эксперимент по отслеживанию одиночных квантов. Специальный алгоритм был полностью разработан в сотрудничестве с экспертами по изображениям ISIS. В этом видео мы будем использовать рецептор эпидермального фактора роста в качестве модели для описания метода данной техники.

Рецептор эпидермального фактора роста представляет собой трансмембранный белок. Этот рецептор будет помечен с помощью моноклонального антитела, которое подвергается восстановлению, чтобы сохранить только фрагмент A и B. Фрагмент A и B биотинилируется, после чего связывается со стрептавидином квантовой точки; таким образом, вся система будет точно распознавать рецептор EGF.

Наша цель — представить комплексное описание динамики рецепторов клеточной поверхности. В частности, молекулярные траектории могут отклоняться от броуновской диффузии из-за ограничения их перемещения в пределах нанодоменов. Это может свидетельствовать о наличии взаимодействия, например, с сигнальными партнерами или молекулярными каркасами.

Наша цель — исчерпывающе описать такие события путем их картирования по всей клетке, что требует работы с высоким временным разрешением SPECT в сочетании с высокой плотностью маркировки. Поэтому мы называем этот подход методом многоцелевого трекинга. Первым этапом эксперимента является подготовка образца.

Мы работаем с живыми клетками с добавлением или без добавления антибиотиков. В данном случае мы используем клетки линии COS-7, которые эндогенно экспрессируют рецепторы EGF. После отделения клеток нам необходимо точно подтвердить их количество, чтобы в каждой лунке планшета было одинаковое число клеток.

Точное количество клеток крайне важно для повышения предсказуемости числа квантовых точек на одну клетку. После распределения клеток по лункам H необходимо инкубировать препарат в течение 24 часов при 37 °C с 7% CO2. Следующим этапом является подготовка квантовых точек, конъюгированных с антителами. Квантовые точки представляют собой малые флуоресцентные наночастицы.

Эти частицы представляют большой интерес, поскольку они гораздо более яркие и стабильные по сравнению с классическими флуоресцентными зондами и сигналами. Отношение сигнал/шум очень важно для этого типа экспериментов. В данном случае мы используем полную среду для насыщения окружающего пространства вокруг квантовых точек и для предотвращения агрегации.

После этого мы смешали квантовые точки с соответствующим белком или антителами в соотношении один к одному, чтобы статистически увеличить количество моновалентных квантовых точек. В данном эксперименте мы используем Fab-фрагмент против рецептора EGF, полученный в лаборатории из моноклональных антител и меченный биотином. В течение инкубации (около 15 минут) следует контролировать отсутствие агрегации и сохранение гомогенности, используя шейкер при 1 200 об/мин и 25 °C.

Когда смесь будет готова, ее можно добавить к клеткам. Очень осторожно удалите среду из лунки, чтобы предотвратить отрыв клеток при использовании лабораторного дозатора, и добавьте необходимое для вашего эксперимента количество смеси. В данном случае мы добавим 100 µL смеси на лунку.

После добавления смеси инкубируйте клетки в течение 15 минут. В данном случае при 37 °C и 7% CO2. После этой инкубации в среде может наблюдаться большое количество часто встречающихся сдвоенных точек во взвешенном состоянии.

Эти квантовые точки должны быть удалены перед визуализацией, так как они создают шум. Именно поэтому нам необходимо промыть каждую лунку несколько раз, в данном случае пять раз, чтобы полностью очистить их.

Используйте среду для визуализации без собственной автофлуоресценции. В данном случае мы используем буфер HBSS с апс. Теперь ваши клетки готовы.

Пришло время перейти к установке для сбора данных. Установка состоит из четырех основных частей: инвертированного микроскопа, камеры с высокой чувствительностью, мощной ртутной лампы и инкубатора для поддержания температуры клеток на уровне 37 °C. Свет от ртутной лампы проходит через оптоволокно и фильтровое колесо, прежде чем осветить образец.

Флуоресценция образца фильтруется и регистрируется EMCCD-камерой слева. В настоящее время мы используем масляные иммерсионные объективы с числовой апертурой 1.3 и 1.49. Центральным этапом данного эксперимента является сам процесс сбора данных.

Как только клетки попадают в фокус, мы выбираем репрезентативную клетку с интенсивным окрашиванием. В случае с квантовыми точками мы сначала получаем одно изображение в проходящем белом свете, которое в дальнейшем может быть использовано для проверки внешнего вида клетки и пространственных границ LA podia. Затем мы записываем видео, обычно с частотой 36 миллисекунд, что является максимально возможной скоростью при полном захвате кадра.

Мы используем ПЗС-матрицу с электронным умножением для достижения чувствительности на уровне одной молекулы с достаточным отношением сигнал/шум, составляющим не менее 20 дБ. Обычно оно составляет около 25 дБ; как правило, мы регистрируем 300 кадров. Для оценки данного набора данных достаточно указать путь к каталогу, содержащему видеофайлы.

После ввода команды текст переподключается в MetLab или при вводе команды MTT 23 I, которая сначала отображает графический интерфейс со списком всех используемых параметров, запускается полностью автоматизированный анализ. Основной анализ MTT выполняется для каждого кадра, включая три главные задачи, первая из которых — детектирование в каждом пикселе наличия или отсутствия целевого квантового объекта.

Затем для каждого обнаружения выполняется оценка соответствующих параметров мишени, таких как положение в пикселях, интенсивность сигнала и так далее. В завершение следует этап реконнекции новых мишеней с трассами, которые уже были построены по предыдущим кадрам для каждого пикселя.

Рассматривая локальный субрегион, мы сравниваем две гипотезы о его содержимом: либо только шум, либо сигнал. С учетом функции рассеяния точки, ModuLite имеет узкий пик. Мы используем порог, обеспечивающий достаточно низкий уровень ложных тревог, с частотой менее одного ложного обнаружения на кадр для каждой обнаруженной мишени.

Далее мы выполняем аппроксимацию методом наименьших квадратов по функции Гаусса, чтобы оценить положение, ширину и высоту обнаруженных пиков Гаусса. Это позволяет определить точное положение красителя в клетке с точностью обычно от 10 до 20 нанометров при типичных отношениях сигнал/шум. При высокой плотности пики часто оказываются слишком близкими, и сильные пики могут препятствовать обнаружению более слабых; чтобы решить эту проблему, мы выполняем дефляцию обнаруженных пиков из исходного изображения.

Кроме того, детектирование по остаточному сигналу обычно может привести к повторному смещению 10% пиков. Достижение почти исчерпывающего детектирования крайне важно для точного восстановления связей. Затем набор новых мишеней сопоставляется с набором предыдущих траекторий для данного зрачка.

Для того чтобы по возможности сопоставить каждый след с целью и учесть возможное мерцание, мы используем всю доступную статистическую информацию, полученную на этапе детектирования. Таким образом, цели не просто присваиваются ближайшему следу. В случае конфликтов, когда следы могут пересекаться, что означает перекрытие соответствующих релевантных областей поиска, мы будем учитывать статистические значения интенсивности, скорости, ширины и мерцания как для следов, так и для целей.

Это обеспечивает статистически оптимальный показатель восстановления связей. Данная стратегия позволяет по возможности избежать смещения восстановления связей в сторону ближайших соседей, что означало бы самое медленное движение. Далее мы используем функцию для оценки возможного временного ограничения (конфайнмента) внутри траекторий.

Эта функция обратно пропорциональна локальной диффузии, как было установлено Секстоном-Симпсоном и коллегами. Применение порогового значения позволяет определить эпизоды с ограничением диффузии или без него. Путем итерации по всем траекториям мы можем в итоге составить карту динамики мембраны с точки зрения кратковременного ограничения и признаков замедления, что может быть представлено наглядно.

В качестве альтернативы, при использовании бинарных или дискретных значений этого индекса локализации (confinement index), MTT по умолчанию будет автоматически выполнять эти задачи, сохраняя для каждого видео параметры строк для каждого пика в файл eski для дальнейших углубленных исследований. Типичные результаты, такие как карта траекторий для каждой клетки и гистограммы интересующих параметров, интенсивности пиков, отношения сигнал/шум, локальных значений дефицита, позволяют легко адаптировать этот аспект под любое конкретное исследование. В данном видео будут обобщены типичные результаты, полученные с помощью MTT.

Значительная часть работы заключается в доработке алгоритма, который может потребовать адаптации для специализированных исследований, например, для изучения различных режимов движения или взаимодействий. Однако запуск MTT очень прост. Пользователям необходимо оптимизировать лишь несколько параметров, таких как пространственные и временные ограничения.

При разработке MTT мы стремились полностью пересмотреть аналитические возможности, используемые для каждой задачи. Мы оптимизировали процесс по двум сложным направлениям. Во-первых, работа с высокой плотностью меток для получения максимально детальной пространственной информации о поверхности мембраны, и во-вторых, работа с низким соотношением сигнал-шум (SNR), что обычно позволяет работать при низком уровне освещения и высокой скорости; при этом ограничение подвижности может интерпретироваться как признак лежащего в основе взаимодействия.

Мембранные рецепторы могут взаимодействовать, например, с субмембранным цитоскелетом или пролипидными доменами. Такие события можно исследовать путем анализа вариаций ограниченности (конфайнмента) в пространстве и времени. Динамические показатели можно сравнить с результатами дополнительных методов, таких как FRAP, FCS или FRET.

Исходный код с открытым доступом доступен для академических исследований. Его можно скачать с нашей веб-страницы на CML dot univ в разделе S fr на странице нашей группы, где представлена ссылка для скачивания. Мы также приглашаем заинтересованных представителей промышленности связаться с нами.

Мы хотели бы выразить особую благодарность членам нашей команды и сотрудникам общих исследовательских центров за поддержку и плодотворные дискуссии. Этот проект поддерживается финансированием CNRS в c MAA University Pac Region National de La, а Foundation Medical поддерживается лигой контроллеров. Спасибо за внимание.