Воспроизводимые мыши седалищного нерва и Давка Последующие оценки регенерации полного анализа горы мышц
22 февраля 2012 г.
В этом докладе мы описываем способ раздавить мышь седалищного нерва. Этот метод использует доступны гемостаза щипцы и легко воспроизводимым и производит полный седалищный нерв давка. Кроме того, мы опишем способ подготовить мышцы все крепления подходят для анализа регенерации нерва после седалищный нерв давка.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать простой воспроизводимый метод компрессионной травмы седалищного нерва и анализа реиннервации мышц по целому препарату после такой травмы. Это достигается путем первоначального обнажения седалищного нерва, включая правильное расположение хирургических ретракторов для обеспечения хорошего доступа к нерву. Затем нерв сдавливают гемостатическим зажимом и маркируют древесным углем.
Затем удалите отдельные мышцы, иннервируемые седалищным нервом, из задней конечности. Заключительным этапом является препарирование отдельных мышц для анализа целых препаратов после иммуноокрашивания. В итоге результаты демонстрируют, что воспроизводимое раздавливание седалищного нерва может быть выполнено простым способом, а целые препараты мышц могут быть использованы для анализа последующей регенерации.
Основным преимуществом данной процедуры является то, что она представляет собой простой воспроизводимый метод раздавливания седалищного нерва с последующей оценкой регенерации аксонов. Начните процедуру с анестезии мыши для проведения операции, используя смесь кетамина в дозе 100 мг/кг и ксилазина в дозе 10 мг/кг путем внутрибрюшного введения для минимизации послеоперационной боли. Также мыши делают подкожную инъекцию мелоксикама в дозе 10 мг/кг.
Затем аккуратно выбрейте шерсть на обеих задних конечностях с помощью хирургической машинки для стрижки. После этого нанесите крем для удаления волос из носовых отверстий для полного удаления волосяного покрова. Очистите кожу стерильным ватным тампоном и хирургическим скрабом Betadine.
После этого нанесите офтальмологическую мазь на глаза с помощью стерильного ватного аппликатора. Поместите мышь на чистую пластину из нержавеющей стали на предварительно разогретое гомеотермическое одеяло и поддерживайте температуру тела животного на уровне 37 °C. Затем зафиксируйте все конечности пластырем.
Осторожно расположите заднюю конечность симметрично так, чтобы коленный сустав образовал прямой угол с телом. Затем под микроскопом накройте операционное поле стерильной салфеткой. Выполните полукруглый разрез по срединной линии.
Осторожно отделите кожу от подлежащей мускулатуры, периодически закладывая ее складками. Нанесите около 0.1 milliliters стерильного физиологического раствора, чтобы поддерживать влажность в области хирургического вмешательства в ходе процедуры. Затем вскройте фасциальный слой между большой ягодичной мышцей и передней головкой двуглавой мышцы бедра.
Для выполнения хирургического контроля необходимо обнажить седалищный нерв. Контралатеральный седалищный нерв следует обнажить и мобилизовать, но оставить неповрежденным. Затем верните на место и зашейте ягодичные мышцы.
С помощью ретракторов обнажите экспериментальный седалищный нерв аналогичным образом. Для облегчения визуализации аккуратно освободите седалищный нерв от окружающей соединительной ткани, используя ножницы для иридэктомии.
Затем с помощью тонкого пинцета 5 45 поместите нерв в нижний зажим супертонких гемостатических щипцов, выровняв три фасции рядом друг с другом, а не одну на другой. На гемостатических щипцах имеется гравировка-метка на расстоянии 1,5 мм от их кончика. Перед раздавливанием расположите крайнюю часть седалищного нерва по линии этой метки.
Это обеспечивает равномерную ширину раздавливания и гарантирует, что нерв не выйдет за пределы браншей гемостатического зажима при сплющивании под действием силы сжатия. Если нерв выходит за пределы кончиков зажима, он будет раздавлен лишь частично. Используйте вторую пару гемостатических зажимов, предварительно погруженных в порошкообразный углерод, чтобы отметить место раздавливания.
Раздавите нерв в том же месте раздавливания в течение 15 секунд, совершив три нажатия. Углеродная метка не должна выходить за границы зоны первоначального раздавливания. Это особенно важно в случаях, когда требуется точная разметка места раздавливания: в такой ситуации следует предварительно окунуть пинцет в углерод, чтобы предотвратить широкое распространение углерода в области хирургического вмешательства.
Раскройте зажим в порошковом углероде. Затем осторожно закройте его. Используйте стерильную марлю, чтобы стереть углерод с внешней поверхности гемостатов.
Проверьте зажим при увеличении минимум в три раза, чтобы убедиться, что дробящие поверхности равномерно покрыты порошкообразным углеродом. При необходимости повторите процедуру погружения и протирания, затем верните ткани на место и зашейте ягодичную мускулатуру аналогично противоположной стороне. В завершение закройте разрез кожи с помощью девятимиллиметровых рефлекторных клипс.
Если обнаружится, что рефлекторные зажимы размером девять миллиметров ограничивают движение, можно использовать рефлекторные зажимы меньшего размера или шесть автоматических швов. Вместо этого, после жертвования мыши, аккуратно удалите четыре мышцы задней конечности: большеберцовую переднюю, длинный разгибатель пальцев, длинную малоберцовую и камбаловидную мышцу, закрепив их через соединительные ткани на чашке с черным сардовым покрытием.
Затем промойте их в PBS. После этого зафиксируйте их в 4% параформальдегиде в течение 30 минут. Для препарирования каждой мышцы на чашке Петри с черным сажевым покрытием удалите сухожилия с помощью ножниц для иридэктомии.
После этого утоньшите мышцы, аккуратно удаляя внутренние мышечные волокна. Тщательно сохраните внешнюю поверхность мышцы, включая полосы терминальных пластинок. Затем зафиксируйте полученные мышцы на предметных стеклах «плюс» с использованием Vector Shield и стеклянных покровных стекол размером 22 × 40 мм; загерметизируйте две стороны прозрачным лаком для ногтей. При правильном закреплении на предметном стекле полосы терминальных пластинок должны соприкасаться с покровными стеклами.
На данном примере показан участок сдавливания in situ в области левой задней конечности. Место сдавливания отмечено активированным углем черного цвета. Звездочкой обозначена ветвь большеберцового нерва, иннервирующая мышцы бедра и служащая удобным ориентиром.
При проведении операции по раздавливанию большеберцовая ветвь седалищного нерва выделена синим цветом, малоберцовая — зеленым, а срединный — желтым. На этом полутонком срезе продемонстрировано полное раздавливание, выполненное гемостатическим зажимом. Наконечники стрелок указывают на раздавленные волокна.
Неполное раздавливание, выполненное углообразным пинцетом, показано на другом срезе полутонкого сечения. Наконечники стрелок снова указывают на раздавленные волокна, а стрелки — на сохраненные аксоны. Это рендерированные изображения мышц, смонтированных целиком.
После удаления соединительной ткани и последующего истончения на каждой мышце выделяют полосы нейронных пластинок (nplate). Здесь представлена целая препарация мышцы sous. 14-й день после раздавливания седалищного нерва.
Стрелками indicated области нервно-мышечного синапса, которые были повторно инервированы аксоном. Здесь представлена демонстрация денервированного нервно-мышечного синапса. Наконечники стрелок указывают на отростки шванновских клеток, положительные по Gap 43.
В этом денервированном нервно-мышечном соединении аксоны отсутствуют. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как воспроизводимо раздавливать статический нерв и подготавливать препараты мышц с гормонами для анализа регенерации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном отчете описывается простой и воспроизводимый метод раздавливания седалищного нерва мыши и анализа реиннервации мышц. В этой методике используются общедоступные гемостатические зажимы для достижения полного раздавливания нерва; также приводится способ подготовки цельных препаратов мышц для анализа регенерации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Регенеративная медицина
- Физиология мышц
Теоретическая основа
- Повреждения седалищного нерва могут привести к значительным двигательным нарушениям.
- Понимание процессов регенерации нервов имеет решающее значение для разработки терапевтических стратегий.
- Анализ целых препаратов позволяет получить представление о реиннервации мышц.
- Существующим методам может не хватать воспроизводимости и доступности.
Цель исследования
- Продемонстрировать воспроизводимый метод компрессионной травмы седалищного нерва.
- Подготовить цельные препараты мышц для последующего анализа регенерации нерва.
- Представить простой протокол, который может быть легко внедрен в работу исследователей.
Используемые методы
- Обнажите седалищный нерв с помощью хирургических ретракторов.
- Раздавите нерв гемостатическим зажимом и пометьте его древесным углем.
- Удалите отдельные мышцы задней конечности, иннервируемые седалищным нервом.
- Препарируйте мышцы для анализа целых препаратов после иммуноокрашивания.
Основные результаты
- Метод обеспечивает стабильное и полное раздавливание седалищного нерва.
- Целые препараты мышц могут быть эффективно проанализированы на предмет регенерации.
- Результаты демонстрируют возможность применения данного подхода для изучения восстановления нервов.
- Полученные данные способствуют пониманию процессов реиннервации мышц.
Выводы
- Данный метод представляет собой надежный инструмент для исследователей, изучающих повреждения нервов.
- Анализ целого препарата (whole mount analysis) является ценным методом оценки реиннервации мышц.
- Данный протокол может быть легко внедрен в различных исследовательских условиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод предоставляет воспроизводимую модель для изучения регенерации периферических нервов, позволяя снизить механистические риски при выборе терапевтических мишеней в рамках доклинических программ в области нейронаук. Благодаря стандартизации метода раздавливания седалищного нерва и количественной оценке реиннервации с помощью анализа мышц в целом, этот подход способствует валидации мишеней и разработке анализов для кандидатов в нейропротекторы или нейрорегенеративные препараты. Данный метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет установления связи между аксональным ростом и функциональными показателями реиннервации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы о регенерации аксонов и взаимодействии шванновских клеток на генетически модифицируемой модели.
- Практическая ценность: использование широко доступных линий трансгенных мышей для анализа молекулярных механизмов восстановления нервов с высокой воспроизводимостью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: получение количественных данных, пригодных для визуализации (например, реиннервация нервно-мышечных соединений), для высокопроизводительного скрининга библиотек соединений.
- Практическая ценность: стандартизация маркировки места раздавливания и подготовки мышц для обеспечения согласованности результатов анализа в разных лабораториях и во всех временных точках.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает переход от открытия к доклинической валидации посредством моделирования аксонотмезиса — клинически значимого повреждения периферического нерва.
- Практическая ценность: Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков за счет лонгитюдной корреляции структуры и функции в процессе регенерации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки — от проверки гипотезы о мишени до идентификации ведущих соединений, предоставляя релевантную для конкретного заболевания систему оценки биопрепаратов или малых молекул, направленных на усиление регенерации нервов.
- Биология открытий: способствует уточнению сигнальных путей и функциональной валидации мишеней, обеспечивая точное измерение кинетики регенерации аксонов.
- Скрининг: позволяет получать готовые к анализу препараты тканей с количественно определяемыми зависимыми переменными (например, полосы реиннервированных концевых пластинок) для оценки эффекта соединений.
- Аналитика: обеспечивает получение статистических данных на основе визуализации целых препаратов, что позволяет сравнивать эффективность регенерации при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом благодаря использованию модели грызунов, которая предсказывает ответы при повреждениях периферических нервов у человека.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированную масштабируемую платформу для многократного применения в кампаниях по снижению рисков при выборе мишеней и оптимизации соединений-лидеров.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации мишени за счет прямой визуализации взаимодействий между аксонами, шванновскими клетками и базальной мембраной.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированному усилию сдавления, маркировке участка и протоколу подготовки целого препарата мышцы.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя объективные гистологические показатели регенерации на ранних этапах исследования.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов для нейрорегенерации с учетом рисков на основе данных о функциональной реиннервации.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области микрохирургии, диссекции тканей и иммунофлуоресцентного окрашивания.
- Зависит от наличия стереомикроскопов, гемостатических зажимов и систем визуализации для анализа целых препаратов.
- Необходима межкомандная стандартизация продолжительности сдавливания, техники маркировки и времени фиксации мышц.
- Требуется адаптация при применении модели к различным линиям мышей или генетическим фонам.
- Ограничено необходимостью проведения терминальных процедур и квалифицированного обращения для поддержания единообразия сдавливания и точности маркировки.
