Альгината микрокапсулы в качестве 3D-платформа для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) для разных линий
9 марта 2012 г.
Мы оптимизировали микрокапсулированию технике в качестве эффективного 3D платформой для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток энтодермы и дофаминергических (ДА) нейронов. Он также дает возможность иммунной изоляции клеток из принимающих при пересадке. Эта платформа может быть адаптирована и для других типов клеток.
Данный протокол оптимизирован для инкапсуляции плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека и их дифференцировки в дофаминергические нейроны в 3D-системе. Сначала обработайте колонии ингибитором ROCK (RI), диссоциируйте их до состояния отдельных клеток, смешайте с альгинатом натрия и пропустите через устройство для инкапсуляции. Продолжайте обработку RI в течение трех дней, затем перенесите инкапсулированные клетки на PA six cells и дифференцируйте в течение 28 дней.
В конечном итоге анализ экспрессии генов и белков демонстрирует более высокую эффективность генерации дофаминергических нейронов. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующим протоколом 2D-дифференцировки является то, что мы стремимся размножать и дифференцировать эти клетки в 3D-среде, которая обеспечивает возможность культивирования клеток с высокой плотностью. Кроме того, это способствует более эффективному межклеточному взаимодействию, необходимому для дифференцировки.
И в-третьих, это обеспечит более высокую эффективность дифференцировки на последующих этапах. Также хотелось бы добавить, что данный метод может быть адаптирован и для других типов клеток, которые можно размножать в 3D-среде. Обратите внимание, что данная методика была оптимизирована с использованием определенного ингибитора ROCK, который предотвращает апоптоз клеток, а также их открепление от культуральных чашек.
Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, поначалу сталкиваются с трудностями, поскольку данная техника обычно не применяется в культурах тканей. Описанный ниже метод инкапсуляции был оптимизирован на основе сводных исследований доктора Дина и доктора Чада по применению R-ингибитора альгината, концентрации альгината и настроек устройства для инкапсуляции. Сейчас Джейми и Ким, аспирантка нашей лаборатории, продемонстрируют этот протокол.
Добавьте 25 milliliters стерильного 0,1% раствора желатина к 275 milligrams очищенного альгината натрия в стерильную пробирку объемом 50 milliliter и перемешайте на вортексе до частичного растворения порошка альгината. Затем поместите пробирку на орбитальный миксер при 10 times G на ночь. После этого добавьте 9% стерильный хлорид натрия к раствору альгината.
Перемешайте на вортексе в течение 30 секунд, затем центрифугируйте при 95 ×g в течение пяти минут. Храните раствор альгината при температуре 4 °C. Сначала в темных условиях проведите предварительную обработку эмбриональных стволовых клеток человека культуральной средой, дополненной 10 µM ингибитора ROCK.
Инкубируйте в течение двух часов при 37 °C. Затем дважды промойте клетки DPBS для их ферментативного отделения. Добавьте аккутан и инкубируйте в течение 10 минут.
При температуре 37 °C осторожно соберите клетки с помощью скрейпера и перенесите их в пробирку объемом 15 мл. Нейтрализуйте Accutane равным объемом среды SL. Затем пропустите нейтрализованные клетки через фильтр с размером пор 40 мкм в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
Теперь используйте гемоцитометр для подсчета количества клеток. Осадите клетки путем центрифугирования, осторожно слейте супернатант. Затем однократно промойте клетки предварительно нагретым раствором.
0,9% раствор хлорида натрия. Центрифугируйте осадок и удалите супернатант. Для инкапсуляции эмбриональных стволовых клеток человека начните с ресуспендирования клеток в предварительно нагретом растворе альгината.
Для этого подсоедините шприц объемом 20 мл к гибкой пластиковой трубке и наберите альгинат в шприц. Затем осторожно перемешайте клеточную суспензию с помощью шприца, избегая образования пузырьков. Теперь наберите клетки в шприц.
Утилизируйте пластиковую трубку, после чего подсоедините шприц к установке для инкапсуляции. Перейдите к настройке оборудования: генератора микросфер, шприцевого насоса, расходомера воздуха и ванны для осаждения хлоридом кальция. Убедитесь, что расстояние между выходным отверстием установки для инкапсуляции и чашкой Петри для сбора составляет 10 сантиметров.
Затем установите скорость подачи шприцевого насоса на 10 milliliters per hour. Скорость потока воздуха — 8 liters per minute, давление — 100 kilo pascals. Собирайте инкапсулированные клетки в предварительно подогретую осадительную ванну в течение семи минут.
Затем аккуратно перенесите их путем аспирации в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл 0,9% Sodium chloride; дайте капсулам осесть на дно пробирки, аккуратно слейте супернатант, затем один раз промойте 0,9% Sodium chloride. Пересуспендируйте инкапсулированные клетки в предварительно подогретой культурной среде с добавлением ингибитора ROCK. Перенесите в культуральный флакон и инкубируйте в течение трех дней.
Высейте клетки стромальной линии мыши PA six в T 75 флакон, покрытый 0,1% желатином, и инкубируйте в среде для кондиционирования дофаминергической нейральной дифференцировки в течение 24 часов. Перенесите капсулы в центрифужную пробирку объемом 50 мл и дайте им осесть на дно пробирки. Удалите супернатант и ресуспендируйте капсулы в кондиционированной клетками PA six среде для дофаминергической нейральной дифференцировки.
Культуральная среда. Инкапсулированные эмбриональные стволовые клетки человека с монослоем из шести клеток PA культивировали в течение 21 дня. При обновлении среды её заменяли.
Каждый раз заменяйте только половину среды, продолжая культивирование шести клеток PA в условиях дофаминергической нейрональной дифференцировки. Среду дополняли индуцирующими факторами в течение одной недели. Сначала аспирируйте капсулы и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
Когда капсулы осядут на дно, удалите супернатант. Промойте дважды DPBS, удаляя супернатант. Затем добавьте пять миллилитров раствора для декапсуляции и тщательно перемешайте суспензию.
Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования осадка декапсулируйте клетки и промойте их дважды раствором DPBS, затем используйте декапсулированные клетки либо для создания монослойной культуры, либо для немедленного последующего анализа. При стандартной подготовке диаметр альгинатных микрокапсул составляет от 400 до 500 микрон.
Здесь представлен анализ с использованием C-F-D-A-P-I. Результаты определяют количество жизнеспособных инкапсулированных клеток (зеленый цвет) при 80% анализах жизнеспособности, пролиферации и апоптоза инкапсулированных эмбриональных стволовых клеток человека в разные временные точки, что служит для оптимизации условий культивирования. Примечательно, что эффекты ингибитора ROCK предотвращают апоптоз, индуцированный диссоциацией, и поддерживают жизнеспособность клеток, указывая на более интенсивный рост инкапсулированных эмбриональных стволовых клеток человека, культивируемых в H-F-F-C-M с добавлением ri.
В данном примере используется инкапсуляция клеток в качестве 3D-платформы для дифференцировки инкапсулированных эмбриональных стволовых клеток человека в дофаминергические нейроны. Как и ожидалось, размер эмбриоидных тел увеличивается со временем; при декапсуляции клетки демонстрируют прогрессирующее развитие нейрональной морфологии через два-три дня культивирования при жизнеспособности более 90%. Анализ экспрессии генов указывает на снижение уровня экспрессии маркера плюрипотентности OCT four.
Важно отметить, что маркер нейропрогениторов PAX6 и маркер дофаминергических нейронов TH остаются экспрессируемыми после семи дней дифференцировки. При дальнейшей дифференцировке эмбриональных стволовых клеток человека спустя 21 день доля TH-положительных нейронов составляет более 90%. Вестерн-блот-анализ подтверждает более благоприятные профили экспрессии TH и PAX6 в системах 3D-культивирования клеток по сравнению с 2D-культивированием.
После освоения данной методики её выполнение занимает около двух часов. Помните о необходимости обработки клеток ингибитором ROCK до и после инкапсуляции. Использование различных индукторов или ингибиторов позволяет адаптировать протокол 3D-дифференцировки для будущих экспериментов.
Данный метод инкапсуляции человеческих ESL и их дифференцировки в 3D-среде позволяет оценивать их потенциал для клеточной терапии ряда заболеваний, в частности болезни Паркинсона.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен оптимизированный метод микроинкапсуляции для размножения и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в дофаминергические нейроны в 3D-среде. Этот метод усиливает межклеточные взаимодействия и обеспечивает иммуноизоляцию при трансплантации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология стволовых клеток
- Дифференцировка клеток
Введение
- Эмбриональные стволовые клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Дофаминергические нейроны имеют решающее значение для лечения нейродегенеративных заболеваний.
- Системы 3D-культивирования улучшают рост и дифференцировку клеток.
- Методы микроинкапсуляции могут повысить выживаемость клеток при трансплантации.
Цель исследования
- Оптимизировать метод микроинкапсуляции для дифференцировки стволовых клеток.
- Повысить эффективность получения дофаминергических нейронов.
- Создать платформу для иммунологической изоляции клеток.
Используемые методы
- Плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки человека обрабатывали ингибитором ROCK.
- Клетки инкапсулировали с использованием альгината натрия и устройства для инкапсуляции.
- Инкапсулированные клетки культивировали для дифференцировки в течение 28 дней.
- Для оценки эффективности дифференцировки проводили анализ экспрессии генов и белков.
Основные результаты
- Метод 3D-микроинкапсуляции значительно улучшил процесс получения дофаминергических нейронов.
- Наблюдались более высокая плотность клеток и более интенсивные межклеточные взаимодействия.
- Анализ экспрессии генов и белков подтвердил повышение эффективности дифференцировки.
- Данный метод обладает преимуществами по сравнению с традиционными протоколами 2D-дифференцировки.
Выводы
- Оптимизированный метод микроинкапсуляции эффективен для дифференцировки стволовых клеток.
- Системы 3D-культивирования обеспечивают значительные преимущества для пролиферации клеток.
- Данный подход может быть адаптирован для других типов клеток в регенеративной медицине.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Трехмерные платформы на основе альгинатных микрокапсул обеспечивают масштабируемую пролиферацию и направленную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) с повышенной жизнеспособностью и специфичностью линий. Эта система решает проблему воссоздания ниши стволовых клеток, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки методов клеточной терапии и регенеративной медицины. Данный подход повышает ценность исследовательского портфеля за счет создания стабильных высокоплотных культур и эффективного получения релевантных типов клеток для последующих трансляционных исследований.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать пути дифференцировки стволовых клеток в контролируемой 3D-микросреде.
- Обеспечивает функциональную валидацию специфической дифференцировки линий, например, генерации дофаминергических нейронов.
- Способствует механистическому снижению рисков путем изоляции влияния факторов микросреды на судьбу клеток.
- Повышает прогностическую достоверность гипотез о клеточной терапии.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимую 3D-систему для количественной оценки эффективности дифференцировки.
- Позволяет стандартизировать измерения жизнеспособности, пролиферации и апоптоза в различных условиях.
- Подготавливает валидированные популяции клеток для последующего скрининга соединений или фенотипического анализа.
- Поддерживает масштабируемость и повторное использование платформы для различных клеточных линий.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, релевантным для изучения заболеваний, обеспечивая эффективную генерацию дофаминергических нейронов для исследований нейродегенерации.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет поддержания высокой жизнеспособности и точности клеточного происхождения.
- Способствует принятию обоснованных с учетом рисков решений о продвижении кандидатов для клеточной терапии.
- Позволяет проводить исследования иммуноизоляции, релевантные для изучения трансплантации.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Этот метод 3D-инкапсуляции охватывает все этапы — от раннего поиска до доклинических исследований, обеспечивая как валидацию мишени, так и трансляционную преемственность.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы о детерминации клеточных линий и влиянии микроокружения.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных культур высокой плотности для воспроизводимых количественных показателей.
- Аналитика: предоставляет данные об экспрессии генов и белков для сравнительного анализа протоколов дифференцировки.
- Трансляционные исследования: способствует созданию типов клеток, имеющих значение для конкретных заболеваний, для доклинического моделирования.
- Корпоративное повторное использование: адаптируемая платформа для различных типов клеток и протоколов дифференцировки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и уменьшает механистическую неопределенность при дифференцировке стволовых клеток.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов 3D-культивирования клеток.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет получения надежных данных на ранних стадиях.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации программ клеточной терапии и регенеративной медицины с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с трехмерными (3D) культурами клеток и эксплуатацией устройств для инкапсуляции.
- Необходим доступ к аналитической инфраструктуре для анализа экспрессии генов и белков.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов инкапсуляции и дифференцировки.
- Метод adaptable к различным типам клеток при условии оптимизации протокола для достижения специфических результатов дифференцировки линий.
- На начальном этапе новым пользователям, не знакомым с методами 3D-инкапсуляции, потребуется время на обучение.
