Прижизненное микроскопия Селезенка: Количественный анализ паразитов Мобильность и кровотока

В данной процедуре представлен метод количественной интравитальной микроскопии для оценки динамики прохождения паразитов через селезенку. В модели малярии у грызунов мыши, зараженные трансгенными паразитами с GFP, подготавливают к интравитальной микроскопии; канюляция вены селезенки позволяет вводить интравитальные красители. В ходе эксперимента визуализируют перемещение флуоресцентных клеток в различных областях селезенки.

Мы представляем методологию описания мобильности паразитов в трехмерном медленном компартменте красной пульпы и расчета кровотока в сосудах. Эти параметры были использованы для сравнения динамики селезенки у двух штаммов PULE. Здравствуйте всем.

Меня зовут Нандо Эль Портильо, и одним из основных исследовательских вопросов в моей лаборатории является изучение роли селезенки при малярии. Спленомегалия является одним из характерных признаков этого заболевания, однако из-за технических и этических проблем проведение исследований этого органа крайне затруднительно. Чтобы решить эту задачу, мы внедрили технологии, которые позволяют нам наблюдать за динамикой перемещения этого паразита и количественно оценивать данное явление.

Это то, что Лорена и МИ объяснят в данных протоколах. Данное исследование частично проводится в сотрудничестве с группами доктора Лера из Гамбургского университета в Германии и доктора Марии Кбо здесь, в госпитале Clinic, и получило общее финансирование от фонда Cellex и министерства CIA In Espanol. Инфицирование начинается с донора M, зараженного либо летальными, либо нелетальными паразитами GFP, при уровне паразитемии 10%. Для проверки наличия паразитов возьмите небольшую каплю крови из хвостовой вены мыши и распределите ее на предметном стекле для микроскопии.

Подготовьте мазок крови для окрашивания по методу GIMs. Данный раствор позволит визуализировать инфицированные эритроциты после высыхания. Зафиксируйте мазок крови метанолом в течение двух минут, нанесите раствор GIMs и инкубируйте в течение 20 минут. Промойте предметное стекло проточной водопроводной водой и высушите. Подсчитайте процент инфицированных эритроцитов по отношению к общему количеству эритроцитов, используя световой микроскоп с иммерсионным объективом 100x.

Заразите мышей летальными или нелетальными паразитами, полученными из крови хвоста мышей-доноров и разведенными в PBS. Скорректируйте дозу так, чтобы ввести 0.5 млн паразитов на мышь для достижения уровня паразитемии в периферической крови 1% на третий день после заражения; вводите внутрибрюшинно. В качестве контроля можно использовать эритроциты, меченные FITC.

У мыши собирают один миллилитр артериальной крови; полученный после центрифугирования осадок промывают в PBS с содержанием EDTA, затем ресуспендируют в растворе FITC и инкубируют в течение двух часов в темноте при осторожном перемешивании. По истечении этого времени супернатант удаляют путем центрифугирования и проводят тщательную промывку. Препарат вводят контрольной мыши до достижения средней концентрации 1% в периферическом кровотоке, после чего приступают к экспериментам in vivo.

Здравствуйте, я Мия. Чтобы визуализировать селезенку in vivo, нам необходимо провести небольшую операцию на животном, чтобы открыть селезенку; очевидно, что эта техника была освоена мною благодаря Стефани GR в лаборатории Уокера Хейслера, которой я хотела бы выразить благодарность, и сейчас я покажу вам, как следует действовать.

Визуализация инфицированного миоза проводилась на третий день после инфицирования, когда уровень парата составлял 1% у обоих штаммов. На протяжении всей процедуры поддерживайте наркоз у мыши и регулируйте температуру. Защитите глаза от пересыхания и, перед началом действий, убедитесь в полном отсутствии сознания у мыши, проверив реакцию подушечки лапы, чтобы облегчить внутривенное введение веществ.

В ходе эксперимента выполните канюляцию хвоста мыши для установки канюли. Вставьте небольшую иглу в один конец трубки, а аппликатор — в другой. Заполните канюлю физиологическим раствором, удалив пузырьки воздуха, и убедитесь, что раствор правильно проходит через канюлю.

Произведите канюляцию латеральной вены хвоста. Для улучшения видимости вены аккуратно пережмите основание хвоста. Введите кончик канюли в просвет вены.

Появление крови укажет на правильное положение иглы. Если этого не произошло, повторите канюляцию выше по венозному руслу, затем зафиксируйте канюлю на хвосте с помощью клея и пластыря. Обнажите нижнюю часть селезенки через небольшой разрез кожи и мускулатуры с левой дорсальной стороны животного.

Поместите селезенку в место, где наблюдается минимальное движение при дыхании, и нанесите PBS на открытую поверхность, чтобы очистить ее от шерсти мыши и предотвратить высыхание. Накройте селезенку защитным стеклом для обеспечения визуализации. Здравствуйте, меня зовут Лорена.

Представленный протокол позволит визуализировать перемещение паразитов PULI через селезенку. Это стало возможным благодаря использованию трансгенных паразитов GFP. Предоставлено Джеймсом Бёрнсом из Университета Дрексель.

Визуализация перемещения флуоресцентных паразитов позволит определить, существуют ли различия в поведении летальных и нелетальных штаммов. Эксперименты по живой микроскопии проводились на мультифотонном микроскопе Leica, оснащенном системой инкубации с контролем температуры и глицериновым объективом 63 x. Поместите животное на предметный столик микроскопа покровным стеклом вниз, так чтобы селезенка была обращена к объективу. Изначально.

Визуализация селезенки при малом увеличении позволит получить общее представление о микроциркуляторной структуре органа. Сфокусируйтесь на селезенке, используя аутофлуоресценцию ткани; паразиты, экспрессирующие GFP, наблюдаются при перемещении через различные области селезенки. Здравствуйте, меня зовут Мария Альбо из Научно-технологических центров Барселонского университета, и мы проведем intravital-визуализацию селезенки.

Для изучения кровотока и подвижности инфицированных эритроцитов мы будем использовать конфокальный микроскоп, оснащенный резонансным сканером, который обеспечивает высокую скорость визуализации, что крайне важно для компенсации движения органа. Это спектральный микроскоп, позволяющий выбирать диапазон обзора. Для максимально быстрой визуализации мы будем проводить одновременную регистрацию двух флуоресцентных меток и отраженного сигнала.

Выберите различные зоны для визуализации с помощью эритроцитов, рефлексии, контрастирования и красителей Видаля для демонстрации микрососудистой сети селезенки. Теперь мы объясним, как измерить подвижность паразитов в кровотоке сосудов, используя микроскопию по Видалю и программное обеспечение Image J для отслеживания перемещения паразитов в трехмерной сети красной пульпы. Получите изображения на пяти Z-глубинах, используя режим высокоскоростного сканирования.

Преобразуйте стеки изображений в Z-кодированные цветные видеоролики для облегчения отслеживания отдельных флуоресцентных клеток. В тексте представлена подробная информация о том, как отслеживать различные частицы с течением времени по глубине в каждом видео с использованием координат X, Y, Z и T. Параметры подвижности, такие как направленность, средняя скорость и время пребывания, могут быть рассчитаны и представлены в виде карт распределения для проведения сравнительного анализа между популяциями штаммов. Сосудистый кровоток в селезенке можно визуализировать путем системного введения нескольких флуоресцентных молекул, таких как декстрин, описанных в справочной таблице.

Затем, используя эндогенный рефлекс-контраст эритроцитов, просканируйте кровоток по центральной линии, расположив сосуды горизонтально по направлению лазерного сканирования и применив усиленное усреднение по линии (Line average). На этих изображениях полосы, возникающие из-за движения клеток, будут использованы для расчета кровотока; следует делать снимки сосудов разного диаметра и на разных этапах сердечного цикла для компенсации колебаний. Селезенка долгое время считалась «черным ящиком» в исследованиях малярии, и в данной работе мы разработали количественный подход к intravital микроскопии, чтобы получить представление о динамике паразитарной инфекции и кровотока в этом органе, что позволило нам ответить на важные биологические вопросы, такие как адгезия инфицированных эритроцитов к селезенке in vivo.

Спасибо и.