Магнитно резонансная Эластография методологии по оценке тканей Разработан Construct роста
9 февраля 2012 г.
Процедура демонстрирует методику магнитного резонанса эластографии для мониторинга инженерных результат жировой ткани и остеогенной инженерных конструкций по неинвазивной оценки местных механических свойств с помощью микроскопических магнитных эластографии резонанса (μMRE).
Для исследования сконструированных тканевых конструктов традиционные методы механического тестирования, которые часто приводят к разрушению образца, неприемлемы. В данном методе используется микроскопическая магнитно-резонансная эластография или микро-МРЭ в качестве неинвазивного способа измерения механических свойств небольших фрагментов мягких тканей. Сначала клетки высевают на каркас из биоматериала для формирования ткани.
Ткань помещают в агарозный гель, после чего в гель вводят наконечник актуатора. Затем, для определения характеристик, движение актуатора передается образцу и регистрируется с помощью доплеровского виброметра.
Образец и актуатор переносят в магнит и систему магнитного резонанса. Выполняют получение изображений эластографии. Анализ полученных изображений позволяет определить изменение модуля сдвига как для остеогенных, так и для адипогенных конструктов.
Сначала нам пришла в голову идея этого метода; мы наблюдали за использованием магнитно-резонансной эластографии в диагностике заболеваний и поняли, что её можно применить в тканевой инженерии. Основным преимуществом данного метода перед другими существующими способами, такими как механические испытания, является применение неинвазивной технологии МРТ для анализа основных механических свойств тканей. Применение этого метода в тканевой инженерии обосновано тем, что знание механических свойств позволит гарантировать соответствие тканей предполагаемым целям использования в инженерии костной и хрящевой тканей.
Хотя эти методы дают ценные сведения для тканевой инженерии, они также могут быть использованы для диагностики заболеваний различных органов, например, фиброза печени, черепно-мозговой травмы или рака мозга. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку она включает этапы, которые трудно освоить, а также требует предварительных знаний в области тканевой инженерии и магнитно-резонансного имиджинга. Процесс подготовки тканевой конструкции состоит из трех основных этапов: экспансии клеточной популяции, посева клеток на биоматериальный скаффолд и дифференцировки с использованием химических сигнальных молекул.
После культивирования и экспансии клеточной линии высейте мезенхимальные стволовые клетки человека или HMCs на желатиновую губку с плотностью 1×10⁶ клеток/мл для формирования костной ткани. Примерно через три дня клетки должны достичь конфлюэнтности на скаффолде для индукции дифференцировки. Удалите среду и замените ее средой для индукции адипогенеза.
Затем через три дня инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере с 5% CO2. Замените среду на поддерживающую среду, которая состоит из среды для экспансии, содержащей 10 µg/mL рекомбинантного человеческого инсулина. После инкубации в течение 24 часов замените поддерживающую среду на индукционную среду.
Повторите этот цикл три раза. После этого каждые два дня заменяйте поддерживающую среду в течение четырех недель для индукции остеогенеза. На протяжении всего исследования заменяйте остеогенную среду на свежую каждые два дня.
В данном исследовании период наблюдения составляет четыре недели, и каждую неделю проводится МРЭ. Магнитно-резонансная эластография основана на распространении механических сдвиговых волн для оценки локальных значений механических свойств. Следовательно, эти механические колебания должны генерироваться и характеризоваться в исследуемой ткани с помощью пьезоэлектрического актуатора. Для подготовки образца перенесите культуру ткани в пробирку диаметром 10 мм, содержащую твердое основание и слой 0,5% AGROS геля.
Затем добавьте теплый 0,5% агарозный гель, чтобы закрыть образец. Дайте агарозному гелю застыть в течение пяти минут.
При комнатной температуре введите наконечник пьезоэлектрического привода изгиба в поверхность геля. Затем закрепите трубку с образцом и актуатор на жесткой опоре. Направьте луч лазерного доплеровского барометра на наконечник механического актуатора.
Отрегулируйте положение системы для оптимизации интенсивности отраженного сигнала, отображаемой на барометре. Чтобы максимизировать отражение, при необходимости используйте светоотражающую ленту для настройки актуатора с целью генерации безвредных сдвиговых волн со значительной амплитудой около 250 microns. Настройте генератор функций на сканирование желаемого диапазона частот, используя рабочее напряжение 20 volts peak to peak с сигналом белого шума.
Для данного эксперимента требуемый диапазон частот составляет от 20 до 2000 hertz. Чтобы просмотреть полученный спектр в программе Polytech Rsof, выберите отображение скорости и БПФ (FFT). Начните захват сигнала и определите резонансную частоту системы по пикам спектра.
Затем, чтобы измерить отклонение актуатора, настройте его на подачу непрерывного синусоидального сигнала на определенной резонансной частоте. Используя рабочее напряжение 200 вольт от пика до пика, зафиксируйте создаваемое актуатором смещение поверхности геля; настройте программное обеспечение FiberSoft на отображение БПФ (FFT), где по оси Y будет отложено смещение. После характеристики актуатора поместите пробирку с образцом и актуатором в слот РЧ-катушки диаметром 10 мм, затем установите образец и актуатор в центре МРТ-сканера.
Выполните сканирование-разведку для определения местоположения конструкта. После обнаружения тканевого конструкта установите параметры сбора данных. Для типичного сагиттального сканирования in vitro время повторения составляет 1000 milliseconds.
Время эха от 20 до 40 миллисекунд, толщина среза от 0,5 до 1 миллиметра и поле обзора 12 на 10 мм², при размере матрицы 128 на 128 пикселей. Для параметров эластографии установите частоту актуатора в соответствии со значением, определенным при характеризации с помощью лазерного доплеровского виброметра. Для данного образца необходима одна пара градиентов с амплитудой градиента 50 Гаусс/см и задержкой MRE, установленной на ноль.
Переключите генератор функций в режим пачек (burst mode) и настройте его параметры в соответствии с параметрами сбора данных эластографии, включая частоту и количество циклов. Также установите внешний триггер для генератора функций. Для получения сагиттального изображения установите направление чувствительности к движению в положительную сторону среза и начните сканирование после сбора данных.
Оцените изображение, чтобы определить качество сигнала в тканевой конструкции. Если изображение выглядит слишком темным, скорректируйте параметры МРТ и выполните повторное сканирование. Затем измените сенсибилизацию на отрицательное направление среза.
Перенесите файлы с МРТ-сканера на другой компьютер, оснащенный MATLAB, и запустите программу MATLAB, которая выполнит комплексное деление для генерации изображения, отображающего распространение сдвиговых волн. Оцените изображение на наличие сдвиговых волн и возможных артефактов; для более точной оценки качества и амплитуды волны можно построить профили линий фазового наложения. Если наблюдается наложение фаз, уменьшите амплитуду градиента и проведите повторное сканирование.
Если корректировка изображения не требуется, установите размер массива параметров равным восьми равноотстоящим значениям в диапазоне от 0 с до полного периода характеризуемой резонансной частоты. После получения изображений выполните сканирование в обоих направлениях среза — положительном и отрицательном.
Используйте программу MATLAB, предназначенную для генерации данных сдвиговой волны и соответствующего видео ее распространения в образце. Этот файл потребуется для оценки механических свойств. Заключительным этапом MRE является расчет жесткости сдвига на основе изображений сдвиговой волны.
Начните с загрузки данных в программу MATLAB, которая будет анализировать трехмерный набор данных; укажите параметры визуализации, включая поле зрения, градиент, амплитуду и количество биполярных пар, и запустите код. Алгоритм позволяет выбирать области интереса, для которых рассчитываются среднее значение и стандартное отклонение каждого параметра. Обведите контуры тканевого конструкта, чтобы выбрать область интереса.
Отображаются средние значения и стандартное отклонение жесткости, модуля накопления и модуля потерь в пределах выбранной области интереса. Программа также предоставляет промежуточные результаты, включая вид волны после применения фильтров, вид волны после направленной фильтрации и линейные профили, которые помогают оценить точность восстановления. Для точной оценки отфильтрованная волна должна быть гладкой.
Стандартное отклонение параметра в конкретной области интереса также служит индикатором качества вычислений; при необходимости скорректируйте другие параметры для получения точных значений механических свойств, чтобы наблюдать за изменениями механических свойств инженерных конструктов в процессе их развития. Тестирование методом магнитно-резонансной эластографии (MRE) проводилось в течение четырехнедельного периода. На данной карте развития конструктов показаны адипогенные конструкты (обозначены буквой A) и остеогенные конструкты (обозначены буквой O) с соответствующими изображениями амплитуды, изображениями сдвиговой волны, значениями ELA и отображаемой средней сдвиговой жесткостью.
Цветовая карта для ELA соответствует цветовой схеме шкалы. Диаграмма и планки погрешностей представляют стандартное отклонение внутри каждой области интереса конструктов. Со временем адипогенные конструкты становились менее жесткими, что указывает на свойства, сходные с жировой тканью.
Аналогичным образом, остеогенные конструкции становились более жесткими в течение четырехнедельного периода, что указывало на дифференцировку по костному типу. После освоения эта методика может быть выполнена примерно за два часа при условии правильного проведения. При выполнении данной процедуры важно полностью охарактеризовать актуатор по ее завершении. Для ответа на такие вопросы, как подтверждение отложения минералов, могут быть использованы такие методы, как биохимический анализ и гистология.
Не забывайте, что работа с клеточным материалом человека и использование МРТ могут быть крайне опасными; при выполнении данных процедур необходимо соблюдать меры предосторожности, соответствующие уровню биобезопасности BL2 и требованиям безопасности при работе с МРТ.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной процедуре представлена методика магнитно-резонансной эластографии (МРЭ) для мониторинга созданных методов тканевой инженерии жировых и остеогенных тканевых конструктов. Она использует микроскопическую магнитно-резонансную эластографию (μMRE) для неинвазивной оценки механических свойств.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Тканевая инженерия
Обзор
- Традиционные механические испытания часто приводят к разрушению образцов.
- Неинвазивные методы имеют решающее значение для исследования небольших мягких тканей.
- Решением является микроскопическая магнитно-резонансная эластография.
- Данный метод позволяет проводить локальную оценку механических свойств.
Цель исследования
- Разработать неразрушающий метод оценки тканевых конструктов.
- Мониторинг механических свойств инженерных тканей.
- Углубить понимание результатов тканевой инженерии.
Используемые методы
- Клетки высаживают на биоматериальный каркас.
- Ткань помещают в агарозный гель.
- Кончик актуатора вводят в гель для создания движения.
- Движение актуатора регистрируют с помощью лазерного доплеровского виброметра.
Основные результаты
- Успешное неинвазивное измерение механических свойств.
- Характеристика движения актуатора, передаваемого образцам тканей.
- Продемонстрированная эффективность μMRE в тканевой инженерии.
- Полученные данные о механическом поведении искусственно созданных конструктов.
Выводы
- Микроскопическая МРЭ является жизнеспособной альтернативой традиционным методам тестирования.
- Она позволяет сохранить образцы инженерных тканей.
- Данный метод может способствовать развитию области тканевой инженерии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Неразрушающая оценка механических свойств имеет решающее значение для лонгитюдных исследований в области тканевой инженерии, где деструктивное тестирование нарушает целостность образцов и препятствует долгосрочному наблюдению. Магнитно-резонансная эластография (MRE) позволяет проводить повторный количественный мониторинг созревания конструктов без разрушения образцов, что помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки на доклиническом этапе. Данный подход снижает риск потерь биологического материала, обеспечивая прогностические и механистически значимые показатели, коррелирующие с функциональными результатами тканей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимосвязь между структурой и функцией путем корреляции механической жесткости с состояниями дифференцировки в адипогенных и остеогенных линиях.
- Практическая ценность: обеспечивает проверку гипотез относительно условий применения биоматериалов и сигнальных молекул с помощью продольного неинвазивного мониторинга созревания конструкта.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет создавать количественные карты жесткости при сдвиге с высокой корреляцией (R²>0,9914) с данными динамического механического анализа, что обеспечивает стандартизацию анализа.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимые механические показатели на уровне вокселей, подходящие для высокопроизводительного скрининга условий культивирования клеток и свойств скаффолдов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет отслеживать механофенотипические изменения в процессе дифференцировки hMSC, связывая эволюцию механических свойств с функциональностью ткани.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность непрерывного мониторинга в ходе многонедельных исследований, снижая необходимость в терминальных деструктивных анализах и поддерживая дизайн лонгитюдных исследований.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Находясь на этапе между ранним созданием конструктов и функциональной валидацией, μMRE служит механистическим связующим звеном в континууме открытий, позволяя подбирать наиболее перспективные кандидаты на основе количественного биомеханического фенотипирования.
- Открывающая биология: способствует снижению рисков при изучении механизмов путем корреляции временных изменений жесткости со специфической для данной линии дифференцировкой, что уменьшает неопределенность при валидации мишени.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные количественные результаты (жесткость на сдвиг, модуль накопления/потерь), что позволяет проводить сравнение различных составов конструктов и условий культивирования.
- Аналитика: поддерживает статистический анализ траекторий изменения механических свойств, облегчая принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении («go/no-go») оптимизации конструкта.
- Трансляционные исследования: сопоставляет показатели механических свойств с функциональностью ткани, предоставляя трансляционный биомаркер-суррогат для оценки зрелости конструкта и потенциала его интеграции в организм реципиента.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую неразрушающую платформу, применимую для различных типов тканей (кость, хрящ, жировая ткань) и моделей заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет установления связи между механическими фенотипами и функциональными результатами в тканях, что снижает механистическую неопределенность в доклинических моделях.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированной калибровке актуаторов, синхронизации с МРТ и автоматизированным рабочим процессам картирования жесткости.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования ресурсов за счет сохранения образцов для мультимодального анализа (например, гистологии, биохимических анализов) и сокращения потребности в создании повторных конструктов.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов из конструктов с учетом рисков на основе количественных лонгитюдных профилей механического созревания.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области физики МРТ, механического воздействия и анализа обратных алгоритмов для точной количественной оценки жесткости.
- Зависимость от специализированного оборудования, включая пьезоэлектрические актуаторы, лазерные доплеровские виброметры и совместимые с МРТ системы доставки.
- Необходима межкомандная стандартизация параметров эластографии (частота, амплитуда градиента, биполярные пары) между центрами для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Требуется адаптация под различные размеры конструктов, составы гелей и сроки созревания для оптимизации распространения волн и соотношения сигнал/шум.
- Практические ограничения включают более длительное время сбора данных по сравнению с конечными анализами и возможное затухание сигнала в высокоплотных или кальцинированных конструктах.
