Производство тканей Microarrays, иммуногистохимического окрашивания и цифровизации В правам Атлас белка

Общая цель данной процедуры заключается в использовании эффективного метода получения одновременной информации об экспрессии белков из нескольких тканей для высокопроизводительного проекта, такого как атлас белков человека. Это достигается путем предварительного выбора репрезентативных участков формалиново-фиксированных тканей, залитых парафином. Затем из отмеченных областей вырезаются цилиндры, и выбранные керны собираются в единый парафиновый блок — тканевой микроматричный массив.

Затем из ТМА делают срезы и проводят иммуногистохимический анализ. Наконец, анализируют паттерн экспрессии белка, и данные публикуются в атласе белков человека (Human Protein Atlas). В конечном итоге позволяют получить результаты, демонстрирующие экспрессию белков в тканях и клетках с помощью тканевых микромассивов и иммуногистохимии.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как проведение иммуногистохимического анализа из целых блоков паренхимы ткани, является возможность сохранения ценного биологического материала и более высокая воспроизводимость экспериментов. Еще одним преимуществом этой техники является снижение затрат на патологоанатомические исследования, а также сокращение времени лабораторной обработки. Эту процедуру по получению ядер ткани стандартизированной длины продемонстрирует Ян Колл Бей, лаборант моей лаборатории.

Отметьте положение стилета. Рекомендуется оставить поля по 2,5–3,0 миллиметра с каждой стороны парафинового блока, чтобы избежать растрескивания парафина при установке соответствующих пробойников. Ослабьте винты с внутренним шестигранником, фиксирующие пробойник, и расположите пробойник таким образом, чтобы паз в ступице пробойника плотно прилегал к металлическому стержню в пластиковом V-образном блоке.

Затяните винты, убедившись, что край металлического зажима расположен горизонтально. Установите пробойник реципиента слева, а пробойник донора — справа. Используйте ручки регулировки XY и их цифровые микрометрические показатели для перемещения пробойников по осям X и Y.

Чтобы сбросить настройки аппарата, нажмите кнопку обнуления (zero a BS) для переключения между дюймами и миллиметрами, нажав кнопку inch millimeter. При использовании просекателя диаметром 1 мм для шаблона 9х8 расстояние между отверстиями, измеренное между их центрами, должно составлять 2 мм, чтобы предотвратить слишком глубокое погружение приемного просекателя и его повреждение. Установите максимальную глубину погружения просекателя, поместив пустую кассету в держатель и используя ограничительный винт глубины в верхнем левом углу направляющей Z; настройте нижнее положение приемного просекателя на уровне 1 мм выше дна кассеты. После выбора и разметки соответствующей области на срезе ткани и разработки шаблона для создания тканевого микромассива поместите приемной блок в держатель и затяните винты с помощью самой маленькой отвертки.

Избегайте чрезмерного затягивания винтов, чтобы парафин не отслоился от кассеты. Надавите на приемный пробойник вниз примерно на пять миллиметров в приемный блок и с помощью ручки пробойника совершите несколько поворотов вперед-назад. Затем медленно снимите давление, чтобы пружины могли вернуть пробойник в исходное положение.

Используйте стилет, чтобы опорожнить просекатель и удалить парафиновый цилиндр. Затем поверните револьвер, чтобы переключиться на просекатель для донора. После этого установите мостик с блоком донора над держателем блока реципиента.

Используйте соответствующий предметный стекле с окрашиванием гематилином и эозином, где отмечена интересующая область, чтобы локализовать ткань, которую необходимо отобрать. Левой рукой зафиксируйте донорский блок в нужном положении, а правой — нажмите на просекатель. Не давите на стилет. Ограничитель глубины не блокирует движение просекателя в правильном положении для донорского блока, поэтому важно прекратить нажатие, когда на стилете станет видна вторая метка.

Медленно поверните ручку пробойника один раз. Снимите downward pressure, продолжая удерживать донорский блок на мостике для донорского блока. Извлеките мостик и донорский блок.

Убедитесь, что донорский пробойник совмещен с отверстием, сделанным ранее. Отрегулируйте положение пробойника с помощью установочных винтов. Если донорский пробойник и отверстие в реципиентном блоке не совмещены, осторожно надавите на пробойник вниз, пока его кончик не достигнет верхней части отверстия в реципиентном блоке.

Удерживая это положение, с помощью стилета поместите столбик ткани в отверстие. Поверхность столбика должна быть выровнена по поверхности блока. Переместите турель обратно к приемному просекателю.

Переместитесь к следующей позиции с помощью ручек регулировки XY и повторите процесс выбивания образца из реципиентного блока до полного заполнения массива. Чтобы извлечь реципиентный блок, ослабьте винты в держателе. Положите блок лицом вниз на предметное стекло, размещенное на подходящем штативе, и просушите блок при температуре 42 °C в течение 40 минут.

Извлеките предметное стекло и блок из печи и выровняйте поверхность блока, осторожно проведя по нему предметным стеклом. Поместите блок с предметным стеклом на охлаждающую пластину на 10 минут. Снимите предметное стекло с блока.

Блок готов и может быть подвергнут секционированию. После секционирования проводят окрашивание и оцифровку тканевого микромассива с использованием антител к интересующему белку. Поиск белка в атласе белков человека осуществляется на веб-сайте www.proteinatlas.org.

Введите идентификатор ансамбля (ensemble id), номер доступа UniProt или название HGNC интересующего вас белка, например, insulin. Нажмите на выбранный белок и прокрутите страницу вниз до раздела «нормальные ткани и органы» (normal tissue and organ summary). В обзоре будет показана экспрессия белка в поджелудочной железе.

Нажмите на вкладку «More tissue data» (Дополнительные данные о тканях). Отобразится список нормальных тканей, отсортированный по органам.

Нажмите на поджелудочную железу, чтобы просмотреть результаты ИГХ для трех антител, направленных против одного и того же белка. Нажмите на изображение, чтобы просмотреть изображение поджелудочной железы в высоком разрешении. На данном рисунке представлены примеры качества тканевых микромассивов: прямой и правильно выровненный массив с достаточным расстоянием между рядами, столбцами и краем парафина. Здесь некоторые керны расположены слишком близко к краю, что, вероятно, приведет к проблемам при нарезке срезов.

Этот тканевый микромассив подвергался слишком долгому прогреву и деформировался из-за отсутствия подходящего шаблона. Здесь представлен правильно срезанный образец с прямыми и выровненными колонками, окрашенный гематоксилином и эозином. Использование некачественного или загрязненного лезвия может привести к разрывам, как показано здесь, или к образованию сжатых срезов, как в данном случае.

Клетки герминативного центра в лимфатических узлах демонстрируют оптимально титрованные антитела, что приводит к специфическому цитоплазматическому окрашиванию без фона, как показано здесь. Отрицательное или слабое окрашивание наблюдается, когда концентрация первичных антител слишком низкая или если целевой белок отсутствует в иммуноокрашенных тканях. Данный срез ткани чрезмерно окрашен из-за слишком высокой концентрации первичных антител.

Темный цвет создает трудности при определении субклеточной локализации из-за перекрытия спектров, перекрестной реактивности и ложноположительных результатов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать массив тканевых маркеров и как использовать его при анализе экспрессии белков методом иммуногистохимии. Вы также должны понять, как пользоваться атласом белков человека (Human Protein Atlas) для изучения экспрессии белков в тканях и клетках человека.