Методы изучения морфогенеза нейронов:

Общая цель следующего эксперимента заключается в проведении экспресс-оценки функции генов при развитии коры головного мозга с использованием органотипических срезов. Это достигается путем введения в кору головного мозга мыши плазмид, коэкспрессирующих ингибирующую РНК и маркер GFP. На мозг воздействуют короткими электрическими импульсами, что обеспечивает трансфекцию нейрональных клеток-предшественников плазмидной ДНК.

Затем мозг препарируют, заливают в блок и нарезают для получения органотипических срезов, в которых может происходить нейрональный морфогенез ex vivo. В органотипических срезах можно вести поиск субпопуляций кортикальных нейронов с миграционными или морфологическими дефектами путем прямого наблюдения за клетками, меченными GFP. Здравствуйте, добро пожаловать в мою лабораторию на кафедре молекулярной биологии Университета Брауна; сегодня доктор Лиза и два студента, Кэт Зер и Марк Себа, продемонстрируют метод электропорации ex vivo и культивирование органотипических срезов, что является очень полезным методом для исследований нейроразвития.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в различных аспектах нейроразвития, включая нейрогенез, миграцию нейронов и морфогенез нейронов. Поскольку этот анализ проводится в условиях, максимально приближенных к среде IBU, он представляет собой недорогую и быструю альтернативу созданию трансгенных животных или животных с нокаутом генов с неизвестной функцией. Наконец, по сравнению с технологией электропорации in vivo, успех данных экспериментов по электропорации не зависит от высокого мастерства при проведении хирургического вмешательства и развитии соответствующих навыков, а может быть реализован за более короткое время обучения и при меньшем уровне подготовки.

После эвтаназии беременной мыши извлеките эмбрионы в ледяной раствор полного HBSS, сохраняя их в индивидуальных плацентарных мешках. Затем в холодном растворе HBSS извлеките эмбрион из мешка и отсеките голову после первого позвонка для проведения инъекции; с помощью специально изготовленного шприца Hamilton поместите голову на лист параформовой бумаги на чашке Петри. Введите от 6 до 8 µL смеси ДНК с fast green через третий желудочек.

Затем смесь заполнит оба боковых желудочка в кортикальных пузырях. Для электропорации используются платиновые электроды-пинцеты BTX. Расположите положительный электрод со стороны коры, которую необходимо подвергнуть электропорации.

Например, при работе с дорсальной корой электрод должен располагаться на верхней части головы. Для достижения высокой эффективности трансфекции всегда доводите концентрацию ДНК до 1 µg/µL и используйте ДНК, выделенную с помощью Maxi prep. При необходимости используйте набор для очистки от эндотоксинов, чтобы очистить ДНК после электропорации.

Перед препарированием выдержите голову на льду не менее пяти минут. При проведении электропорации крайне важно использовать подходящее количество электрических импульсов и силу тока, чтобы избежать повреждения развивающегося эмбрионального мозга. После электропорации ткань становится очень хрупкой.

Важно проводить препарирование очень осторожно, так как кожа и череп могут тянуть за мозговые оболочки кортикальных пузырей, что может привести к их повреждению при извлечении из черепной коробки. Через пять минут извлеките мозг в холодном HBSS, начав с небольшого разреза на боковой стороне головы и отделяя кожу от боковых поверхностей головы.

Затем с помощью тонкого пинцета осторожно отделите мягкую мозговую оболочку от мозга. Извлеките целый мозг из черепной коробки. По завершении поместите мозг в охлажденный на льду раствор HBSS и подготовьтесь к заливке ткани.

Начните заполнять формы 3% низкоплавким агарозом. Поместите формы на лед, чтобы агароза затвердела у дна формы. При этом убедитесь, что мозг остается зафиксированным и центрированным.

Теперь с помощью тонкого пинцета аккуратно извлеките мозг из HBSS, промокните излишки буфера салфеткой Kimwipe или фильтровальной бумагой и поместите мозг в низкоплавкий агароз. Затем с помощью наконечника пипетки перемешайте мозг внутри формы, чтобы максимально увеличить площадь контакта между агарозом и тканью. После переноса всех образцов расположите каждый мозг в форме примерно в одном и том же направлении и на одной глубине.

Агар застынет примерно через пять минут, поэтому действуйте быстро. Дайте агару полностью застыть, инкубируя его еще пять минут на льду.

Обрежьте излишки агара перед установкой блоков. Затем соедините блоки с агаром друг с другом с помощью быстроотверждающего пластикового клея; каждый мозг в стопке должен быть расположен обонятельными луковицами вверх. После соединения блоков подрежьте агар, чтобы убедиться, что вибратом будет срезан каждый мозг.

Затем немедленно погрузите их в ледяной HBSS. Для нарезки блоков установите скорость вибратома на низкое значение, примерно половину от максимального, а частоту вибрации лезвия — на максимальную. Затем сделайте корональные срезы толщиной 250 micron, извлеките их с помощью изогнутого тонкого шпателя и перенесите в лунки для тканей с помощью тонкой кисти или пинцета.

Если ткань выпадает из агароза, значит, контакт ткани с агарозой не был сформирован в достаточной степени в ламинарном шкафу для культивирования тканей; в этом случае подготовьте 6-луночный планшет, налив в каждую лунку по 1,8 milliliters среды для культивирования срезов, и поместите в каждую из них органотипические вставки с полилизином и ламинином. Добавьте 500 microliters среды для культивирования срезов на поверхность органотипических вставок для срезов. Затем перенесите до пяти срезов в каждую вставку.

Затем удалите излишки среды с поверхности срезов. Это необходимо для того, чтобы срезы максимально сохранили свою морфологию и гибель клеток была минимальной. Важно поддерживать полноценный интерфейс «жидкость-воздух», чтобы срезы не плавали в среде. В завершение инкубируйте срезы при 37 °C в увлажненном инкубаторе.

Каждый второй день заменяйте половину объема среды под мембраной. Срезы не должны плавать в среде. Нейроны, экспрессирующие электропорированные конструкции, можно визуализировать уже через восемь часов после электропорации. По истечении необходимого количества дней культивирования зафиксируйте срезы на мембране для анализа.

Промойте каждый органический типовой вкладыш теплым PBS в течение пяти минут. Всего проведите три промывки в PBS, затем зафиксируйте ткань 4% параформальдегидом в течение одного часа при температуре четырех градусов celsius. После фиксации ткани можно проанализировать с помощью клеточных маркеров или просто окрасить красителем по Гуку. Через час промойте срезы трижды по 10 минут в 1X PBS.

Затем инкубируйте срезы в течение двух часов при комнатной температуре в 10% растворе сыворотки козы в 1×PBS при осторожном перемешивании. После этого окрашивайте ткани с помощью антител в течение одного часа при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Удалите краситель, трижды промывая образцы в 1×PBS по 10 минут при осторожном перемешивании.

Поместите матовые предметные стекла в водяную камеру, глубина которой достаточна для того, чтобы ткани были полностью погружены в воду после их переноса на стекла. Для монтажа срезов сначала аккуратно отделите мембрану с помощью скальпеля.

Во-вторых, с помощью тонкого пинцета перенесите до пяти срезов, закрепленных на мембране, на каждое предметное стекло, погруженное в воду. В-третьих, удалите излишки воды с каждого стекла. В-четвертых, нанесите каплю раствора для заключения препаратов на каждый срез мозга.

И наконец, осторожно накройте срезы покровным стеклом и удалите все пузырьки воздуха. После этого, в зависимости от количества электропорированного ДНК и стадии развития эмбриона, срезы будут готовы к микроскопии. Было установлено, что эффективность трансфекции при электропорации варьирует.

Через восемь часов после трансфекции с помощью P-сайленсера клетки с вектором GFP начали экспрессировать GFP. В течение более длительного периода культивирования клетки проходят через нормальную последовательность нейрогенных событий, включая пролиферацию, миграцию и раннюю нейрональную дифференцировку. Эти срезы сохраняли свою морфологию в течение пяти дней при условии надлежащего поддержания интерфейса «среда-воздух» в ходе выполнения данной процедуры.

Важно провести весь эксперимент — с момента эвтаназии животного до помещения срезов в мембранные вставки — менее чем за два часа, чтобы минимизировать гибель клеток после данной процедуры. Другие действия, такие как добавление экзогенных факторов в органотипические срезы, могут быть выполнены для ответа на вопросы, например, о роли различных факторов роста или фармакологических агентов в различных механизмах нейроразвития.