Оценка GFP слова и жизнеспособность использование Тали на основе изображения Цитометр

В данном видео демонстрируется методика определения жизнеспособности клеток, экспрессирующих GFP, с использованием цитометра Tally на основе анализа изображений. Клетки, трансдуцированные GFP, окрашивают с помощью набора для определения жизнеспособности Tally Viability Kit Dead Cell Red, который окрашивает все мертвые клетки в красный цвет с помощью пропидия иодида. Затем клетки переносят пипеткой на предметное стекло для клеточного анализа Tally и помещают в цитометр, который регистрирует и анализирует изображения в светлом поле, а также в красном и зеленом каналах флуоресценции. После этого строятся гистограммы для отображения количества клеток, размера клеток, интенсивности флуоресценции PI и интенсивности флуоресценции GFP в сравнении с традиционной проточной цитометрией.

Система Tali может предоставлять аналогичные данные о жизнеспособности и экспрессии клеток. Однако эта имидж-цитометрия дает дополнительную визуальную информацию об исследуемой популяции клеток. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как проточная цитометрия или флуоресцентная микроскопия, является то, что имидж-цитометр Tali одновременно предоставляет как количественную, так и визуальную информацию о вашем образце клеток.

Кроме того, счетчик проще в использовании, дешевле и занимает меньше места, чем проточный цитометр или флуоресцентный микроскоп. Это позволяет исследователям быстро проводить количественные анализы, такие как определение жизнеспособности клеток, экспрессирующих GFP, непосредственно на лабораторном столе. В данной процедуре клетки U2 OS в концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл были трансдуцированы вирусной конструкцией GFP с ядерной локализацией; для окрашивания погибших клеток использовали пропидий иодид. Перенесите 100 µL клеточной суспензии в новую микроцентрифужную пробирку.

Обратите внимание, что для анализа рекомендуется использовать концентрацию от 1×10⁵ до 1×10⁷ клеток на мл, хотя она не обязательно должна быть точной. Затем добавьте 1 µL реагента Tally Dead Cell Red. После этого коротко перемешайте смесь на вортексе и инкубируйте смесь клеток с красителем при комнатной температуре в темноте от 1 до 5 минут.

После инкубации немедленно перейдите к анализу на цитометре Tally на основе анализа изображений. В системе Tally используются одноразовые пластиковые предметные стекла для клеточного анализа, разработанные специально для этого прибора. При установке стекла всегда держите его за края.

Медленно внесите пипеткой 25 microliters образца в одну из полукруглых зон загрузки. В камеру A загружаются неокрашенные нетрансдуцированные контрольные клетки, а в камеру B — окрашенные клетки, экспрессирующие GFP. Для проведения анализа жизнеспособности клеток, экспрессирующих GFP, нажмите GFP-RFP на главном экране цитометра. Затем в правой части экрана появятся параметры анализа; выберите GFP плюс жизнеспособность.

Затем прибор предложит присвоить название серии образцов. Нажмите «Name now» (Назвать сейчас). Затем с помощью сенсорного экрана введите название серии образцов и нажмите «Save» (Сохранить); талли-цитометр автоматически перейдет к экрану измерения.

Затем, чтобы измерить фоновую флуоресценцию, нажмите вкладку background в нижней правой части экрана измерений, как показано здесь. По умолчанию установлено, что будут просканированы девять полей клеток. Теперь, повернув контрольный образец от прибора, вставьте предметное стекло в загрузочный порт до упора.

Не прилагайте усилий при нажатии на фоновый экран для вставки нового неокрашенного контрольного препарата с клетками. Слайд будет автоматически затянут в прибор, и на экране отобразится изображение живых клеток. С помощью ручки фокусировки приведите клетки в надлежащую плоскость обзора, настраивая фокус.

Передвиньте красный регулятор масштабирования на 4 x или 16 x. Для лучшего обзора клеточной популяции клетки должны быть равномерно темными с ярким ореолом вокруг каждой из них. Как показано здесь, количество клеток может быть занижено, если переход между фоном и краями клеток размыт, из-за чего границы клеток недостаточно четко определены.

Клетки могут быть подсчитаны с избытком, если они имеют светлые центры и темные периметры. После того как клетки окажутся в фокусе, коснитесь или нажмите для запуска контроля неокрашенных клеток. Для измерения фоновой флуоресценции цитометр автоматически сделает снимки и отобразит миниатюры каждого поля зрения.

Индикатор выполнения обеспечивает обновление данных анализа в режиме реального времени. После завершения захвата изображений цитометр автоматически извлекает предметное стекло и предоставляет данные анализа полученных изображений. Сохраненные данные отображаются в выпадающем меню на вкладке фонового режима.

Контрольному образцу фона будет присвоено то же имя, что и эксперименту. Для анализа образца с GFP-трансдукцией, окрашенного пропидиум йодидом (PI), извлеките предметное стекло из прибора, переверните его и вставьте снова так, чтобы образец с трансдукцией был направлен в сторону от прибора. Нажмите вкладку «Sample», а затем нажмите «Press», чтобы вставить новый образец.

Когда изображение появится на экране, используйте ручку фокусировки, чтобы настроить четкость изображения клеток. Как и прежде, затем нажмите «run sample» для запуска анализа образца. После завершения захвата изображения данные анализа отобразятся во вкладке «sample», и цитометр автоматически вытолкнет предметное стекло.

Утилизируйте предметное стекло для подсчета клеток. Поскольку эти стекла являются биоопасными отходами, они не подлежат повторному использованию. После анализа образца к нему можно применить пороговые значения.

Для анализа конкретных популяций клеток здесь мы настроим пороги, чтобы определить процент живых и мертвых клеток. На вкладке образца в разделе клеток, экспрессирующих GFP, будут указаны количество и процент клеток, экспрессирующих GFP, количество и процент мертвых клеток, экспрессирующих GFP, а также общая жизнеспособность. Также отображаются средний размер клеток, количество подсчитанных клеток и концентрация клеток.

Кроме того, в нижней части экрана отображаются гистограммы размера клеток, зеленой и красной флуоресценции. Чтобы установить гейт по размеру клеток, коснитесь миниатюры размера клеток, чтобы открыть соответствующую гистограмму и исключить клеточный детрит. Переместите синие ползунки, чтобы исключить как слишком крупные, так и слишком мелкие события.

Нажмите «apply», чтобы включить клетки внутри гейтов. Затем, чтобы добавить флуоресценцию GFP в анализ, нажмите на эскиз гистограммы GFP, чтобы открыть его.

Переместите синий ползунок, чтобы установить порог сразу справа от самого низкого пика. Используйте контрольный образец в качестве ориентира. Это позволит включить в анализ GFP-положительные клетки, исключив при этом автофлуоресцентные клетки.

Автофлуоресценция часто наблюдается, когда биологические молекулы внутри клеток подвергаются воздействию; нажмите для подтверждения и возврата на предыдущий экран. Данные, отображаемые на вкладке образца, теперь должны отражать гейты и пороги, установленные для обоих каналов флуоресценции. Далее, чтобы отделить окрашенные PI клетки от автофлуоресценции или любого фона, присутствующего в образце, нажмите на миниатюру гистограммы PI, чтобы снова открыть её.

Пик контрольного образца будет отображаться на гистограмме серым цветом. Красным цветом обозначен пик флуоресценции образца. Фоновая флуоресценция на данном приборе отображается в виде пика, расположенного ближе всего к нулевому значению RFU.

Чтобы устранить фоновую флуоресценцию в канале PI, переместите синий ползунок для настройки порога. Чтобы исключить этот пик, используйте серый пик контрольного образца в качестве эталона. После соответствующей установки порога в канале PI нажмите «apply» (применить) для подтверждения и возврата к предыдущему экрану; прибор для подсчета повторно автоматически проанализирует данные и обновит результаты на вкладке образцов.

Затем, чтобы визуально подтвердить правильность назначения каждой клетки, нажмите вкладку масштаба (zoom), после чего выберите захваченное поле зрения для проверки, нажав на миниатюру изображения. Затем нажмите вкладку слоев (layers). После этого нажмите кнопку GFP или PI, чтобы отобразить изображение, полученное через соответствующий канал.

Нажмите эту же кнопку повторно, чтобы удалить слой с дисплея или наложить слои друг на друга; нажимайте кнопки, соответствующие каждому каналу, чтобы определить, как подсчитываются клетки через конкретный канал. Кружками будут отмечены клетки, которые были подсчитаны только по каналу светлого поля; клетки, не проявляющие флуоресценции, будут обведены синим цветом. Это указывает на то, что конкретная клетка является живой клеткой, экспрессирующей сигнал в зеленом канале.

Клетки, экспрессирующие GFP, будут обведены зеленым цветом в красном канале. Клетки, окрашенные PI, будут обведены красным цветом; это мертвые клетки, которые учитываются в обоих каналах. Клетки, окрашенные в красном и зеленом каналах, будут обведены желтым цветом.

Это указывает на то, что клетка экспрессирует GFP, но при этом окрашена pi, а следовательно, является погибшей. Время от времени на экране может появляться черный круг. Это объекты, которые были идентифицированы, но исключены из анализа на основании размера клеток.

Продолжайте настраивать порог на гистограмме флуоресценции, следуя только что описанным шагам, пока каждая клетка, проявляющая флуоресценцию, не будет обведена соответствующим цветом. Все параметры анализа автоматически сохраняются в приборе во вкладке данных.

Счетчик может хранить файлы данных для 500 серий образцов. Каждый файл, сохраненный во вкладке данных, доступен для повторного анализа. При выборе файла во вкладке данных он будет открыт повторно, а все гистограммы и слои станут активными для архивации данных и создания отчетов.

Данные, сохраненные в приборе, могут быть перенесены на компьютер с помощью USB-накопителя. Четыре репрезентативных типа клеток были трансдуцированы вирусной конструкцией GFP с ядерной локализацией, окрашены с использованием набора Tally Viability Kit с реагентом Dead Cell Red и проанализированы с помощью системы Tally на проточном цитометре, как показано здесь. Оба метода показали примерно одинаковый процент экспрессирующих GFP клеток для каждого типа клеток, а также процент от общей популяции клеток, которые были жизнеспособными и экспрессировали GFP.

Эти данные демонстрируют, что цитометр Tali способен различать общую экспрессию GFP в популяции и экспрессию GFP в живой популяции. Мы только что показали, как использовать цитометр Tali на основе анализа изображений для оценки экспрессии флуоресценции и жизнеспособности в вашем образце клеток. Эта технология восполняет пробел между исследованиями отдельных клеток и популяционным анализом.

С помощью цитометра tally на основе анализа изображений можно собирать количественную и качественную визуальную информацию об отдельных клетках, а также о более крупных популяциях клеток. С использованием той же процедуры можно провести несколько других анализов, включая определение апоптоза, экспрессии RFP и жизнеспособности клеток. Для неэкспрессирующих клеток потенциальные области применения включают оценку экспрессии генов и исследования эффективности лекарственных препаратов.