Определение оптимальной цитотоксической активности человека Her2neu специфических CD8 Т-клеток путем сравнения CR51 анализа высвобождения в системе xCELLigence

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении активности цитотоксических Т-клеток путем сравнения метода на основе импеданса с использованием системы EXOGEN и анализа высвобождения хрома. Первый этап осуществляется путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови из цельной крови с помощью центрифугирования. Затем МКПК добавляют в лунки вместе с пептидным антигеном, рекомбинантным человеческим IL-2 и облученными МКПК для создания антигенспецифических CD8 Т-клеток.

Затем антигенспецифичные Т-клетки CD8 в обоих анализах совместно культивируют с опухолевыми клетками для индукции гибели последних. Получаемые результаты показывают процент лизиса опухолевых клеток, определенный как методом импеданса, так и методом высвобождения хрома. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как анализ высвобождения хрома, является то, что система на основе импеданса собирает данные в режиме реального времени и требует меньшего количества клеток, которые не нуждаются в какой-либо маркировке. В данном протоколе кровь здоровых доноров, положительных по HLA-A2, служит источником PBMC или мононуклеарных клеток периферической крови, выделяемых согласно протоколу производителя.

Используйте F call PA plus для отделения P BMCs из крови. Затем в планшеты на шесть лунок внесите примерно 4 миллиона P BMCs в двух миллилитрах среды на каждую лунку. В каждую лунку добавьте связывающий пептид HLAA two до конечной концентрации 10 µg/mL в культуре.

Клетки обрабатывают через день для стимуляции и экспансии T-клеток. Добавляют свежую среду, дополненную рекомбинантным человеческим IL-2 до конечной концентрации 50 units/mL. Через одну неделю готовят культуру аутологичных pbmc, облучают клетки и в течение двух часов подвергают их пульсации тем же hla.

Для повторной стимуляции культур добавьте по 1 мл облученного аутологичного PBM CS с двумя связывающими пептидами в концентрации 10 µg/mL в каждую лунку. Продолжайте добавлять свежую среду с добавлением IL-2 через день. Спустя еще одну неделю повторно стимулируйте культуры таким же образом. После еще шести дней культивирования клетки будут готовы к использованию.

Подготовьте станцию измерения интеллектуального импеданса к работе, выдержав ее при температуре 37 °C в атмосфере с 5% carbon dioxide в течение как минимум одного часа. Соберите человеческие опухолевые клетки при 75% конфлюэнтности, используя 0,25% trypsin и центрифугирование. Подсчитайте количество опухолевых клеток с помощью гемоцитометра и ресуспендируйте их в RPMI.

Среда с опухолевыми клетками в концентрации 7 500 клеток на микролитр. Далее в программном обеспечении xCELLigence настройте страницу разметки (layout page) в соответствии с расположением лунок. На странице расписания (schedule page) установите интервал измерения импеданса каждые пять минут в течение 40 часов; при этом в первые 18 часов система xCELLigent будет измерять импеданс только опухолевых клеток.

Затем добавьте в каждую лунку по 100 µL среды RPMI для опухолевых клеток. Измерьте фоновый уровень на соответствующих EPL, измерив импеданс в отсутствие клеток. После добавления опухолевых клеток установите планшеты в станцию и начните снимать показания.

Опухолевые клетки начнут немедленно прикрепляться к EPL. После примерно 18 часов инкубации опухолевые клетки прикрепятся к EPL и увеличатся в количестве до 15 000 клеток на лунку. В этот момент соберите подготовленные T-клетки с помощью аккуратного соскабливания и центрифугирования с перемешиванием.

Т-клетки ресуспендируют в среде RPMI с 10% FBS и подсчитывают с помощью гемоцитометра. После определения плотности клеток готовят серию двукратных разведений Т-клеток таким образом, чтобы при добавлении 200 µL Т-клеток к опухолевым клеткам максимальная концентрация составляла 40 Т-клеток на одну опухолевую клетку. Последнее разведение в серии должно обеспечивать 1,25 Т-клетки на одну опухолевую клетку.

Приостановите работу станции EXOGEN и удалите EPL с помощью пипетки. Удалите среду из лунок, затем внесите по 200 µL Т-клеток всех концентраций из серии разведений в качестве отрицательного контроля. Используйте чистую среду, верните EPL на станцию и продолжите выполнение программы по завершении анализа.

Нормализуйте результаты. При работе с хромом 51 и целевыми клетками, меченными хромом 51, всегда соблюдайте установленные в учреждении правила радиационной безопасности и используйте экранирование для снижения радиационного воздействия. Начните с пульсации опухолевых клеток в течение двух часов при концентрации 1 миллион клеток на миллилитр, добавив 10 микролитров на миллилитр свежего хрома 51.

Затем промойте опухолевые клетки в 10 миллилитрах среды RPMI с 10% FBS, центрифугируйте их и ресуспендируйте в той же среде до концентрации 1 миллион клеток на миллилитр. Затем в 96-луночный планшет с круглым дном добавьте по 100 000 опухолевых клеток в каждую лунку для расчета спонтанного высвобождения.

В шесть из этих лунок и в шесть других лунок ничего больше не добавляйте. В все остальные лунки добавьте 100 µL Triton X 100 для лизиса клеток и последующего расчета максимального высвобождения. Добавьте Т-клетки в планшет, используя серию разведений, подготовленную ранее.

Теперь инкубируйте планшеты в течение пяти часов и соберите образцы супернатанта объемом 50 µL из каждой лунки; нанесите образцы на планшет Luma после высушивания планшетов в вытяжном шкафу в течение ночи при комнатной температуре. Измерьте их CPM с помощью гамма-счетчика. Раковые клетки T-клеток и SKBR3 культивировали на планшетах xCELLigence и измеряли клеточный индекс, который отражает импеданс планшета, поскольку T-клетки не требуют адгезии для пролиферации.

Их влияние на импеданс было незначительным в течение 40 часов культивирования. В культуре раковых клеток, выращенных отдельно, наблюдалось увеличение показателей импеданса. Однако добавление Т-клеток через 18 часов нарушает эту тенденцию.

Данное событие требует нормализации программного обеспечения после добавления Т-клеток и подробно исследуется в следующем эксперименте. При совместном культивировании клеток SK BR three с различными концентрациями Т-клеток снижение импеданса четко зависело от дозы Т-клеток; данные собирались каждые пять минут в течение трех повторов к 10-му часу наблюдения. Индексы клеток соответствовали полиному второй степени в зависимости от количества Т-клеток, что указывает на то, что станция Exogen в режиме реального времени отслеживает опосредованную CD8 Т-клетками гибель опухолевых клеток SK B three по падению индекса клеток. Чтобы определить, было ли снижение импеданса SK BR three под воздействием Т-клеток антигенспецифичным, проводили дальнейший анализ.

Три клетки SK KBR культивировали совместно с HLA-A2-положительными FLU-специфичными Т-клетками, которые не распознают HER2-neu. Эти клетки проявляли значительно меньшую литическую активность. Чтобы дополнительно определить, уничтожали ли HER2-neu-специфичные Т-клетки мишени антиген-специфичным образом, в совместные культуры добавили антитела к Fas-лиганду. Данные антитела не снизили литическую активность HER2-neu P360-9-специфичных Т-клеток.

Однако при использовании T-клеток, неспецифически активированных с помощью бусин с анти-CD3 и CD28, антитело ингибировало лизис; это позволило определить, происходил ли процесс уничтожения клеток HLA-I-зависимым образом. В совместные культуры добавляли либо антитела к HLA класса I, либо изотипический контрольный антитело. Результаты убедительно подтвердили эту гипотезу.

Затем Т-клетки культивировали совместно с другими раковыми клетками в соотношении один к пяти. В качестве отрицательного контроля была использована линия опухолевых клеток BT 20, негативная по HLA A2. Результаты показывают, что данный метод применим для различных типов адгезивных опухолевых клеток-мишеней.

Кокультуры двух новых P 360 9 специфичных T-клеток HER добавляли к клеткам-мишеням, меченным хромом 51, с последующим анализом CRA. Данный анализ оказался более чувствительным для оценки согласованности. Внутригрупповая вариабельность рассчитывалась как коэффициент вариации в процентах для каждого соотношения клеток от 1:40 до 1:5.

Этот показатель составлял менее 15% при самых низких соотношениях клеток. Однако процентный коэффициент вариации (CV) был высоким или непредсказуемым. Кроме того, была изучена вариабельность лизиса Т-клеток SK BR three при совместном культивировании с различными специфическими линиями Т-клеток P 360 9.

Данные были получены с интервалом в 30 дней. Анализы проводились в трех повторах, и результаты оказались очень схожими. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как определять активность цитотоксических Т-клеток с использованием антигенспецифических CD8 Т-клеток и опухолевых клеток с помощью метода, основанного на измерении импеданса.