Обнаружение токсинного транслокации в хост цитозоля от поверхностного плазменного резонанса

Общая цель данной процедуры — обнаружить и количественно определить пул токсина, который проникает в цитозоль. Для этого токсин сначала связывают с поверхностью клетки-хозяина при температуре 4 °C. Затем несвязанный токсин удаляют, и клетки нагревают до 37 °C, что обеспечивает перемещение токсина в эндомембранную систему и, впоследствии, в цитозоль хозяина; после проникновения токсина в клетку используют дигитонин для селективного пермеизирования плазматической мембраны.

Экстракты клеток разделяют на отдельные мембранные и цитозольные фракции с помощью дифференциального центрифугирования. На заключительном этапе используется поверхностный плазмонный резонанс (сокращенно SPR) для обнаружения и количественной оценки проникновения токсина в цитозоль путем перфузии фракции цитозоля над SPR-сенсором, покрытым антителами к токсину. Данный метод поможет ответить на ключевые вопросы в области биологии токсинов, такие как эффективность и кинетика проникновения токсина в цитозоль, количество токсина, попадающего в цитозоль, а также возможность подавления транспорта токсина в цитозоль с помощью лекарственных препаратов. Перед началом данного протокола подготовьте клетки HeLa для интоксикации, как описано в письменном протоколе после инкубации клеток HeLa в течение ночи.

Замените культуральную среду на 1 мл DMEM, содержащего 100 нг/мл ганглиозида GM1, и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C. Это увеличит количество сайтов связывания для холерного токсина, так как рецептор GM1 токсина будет интерполировать в плазматическую мембрану клеток, подвергнутых воздействию раствора GM1.

После одного часа инкубации удалите среду, содержащую GM, и дважды промойте клетки DMEM. Затем добавьте один миллилитр DMEM, содержащего 1 µg/mL холерного токсина, и выдержите клетки при температуре 4 °C в течение 30 минут. Удалите среду с токсином и дважды промойте клетки.

Затем инкубируйте клетки в 1 мл DMEM при 37 °C в течение требуемого времени. По окончании каждого периода вымывания промойте клетки PBS, а затем инкубируйте каждую лунку с 250 µL 0,5 мМ EDTA в PBS. После 10-минутной инкубации на льду снимите клетки с 6-луночного планшета путем интенсивного тритурации с помощью дозатора P 1000.

После сбора клеток из одной лунки объедините их с клетками из второй, а затем и из третьей лунки той же группы. Затем перенесите полученную объединенную суспензию клеток из трех повторностей в одну микроцентрифужную пробирку. Теперь центрифугируйте пробирку в настольной микроцентрифуге в течение пяти минут.

При центрифугировании при 5 000 ×g должны быть получены клеточные осадки примерно одинакового размера для всех условий. Удалите супернатант, затем ресуспендируйте клеточный осадок в 100 µL предварительно приготовленного и охлажденного 0,04% рабочего раствора дигитонина. Поместите клеточную суспензию на лед на 10 минут, после чего в настольной микроцентрифуге центрифугируйте пермеабилизированные дигитонином клетки при 16 000 ×g в течение 10 минут.

Перенесите супернатантную фракцию, содержащую цитозоль, в новую микроцентрифужную пробирку, а осадок, содержащий органеллы, сохраните. Стандарты токсина SPR готовят в концентрациях 110, 1 и 0,1 нг/мл в буфере HCN. Образцы готовят путем разведения супернатантных фракций цитозоля в буфере HCN до конечного объема 1 мл. Объем образца должен составлять не менее 1 мл, чтобы обеспечить удаление воздуха из петли ввода объемом 500 мкл перед инъекцией. Фракции осадка, содержащие органеллы, ресуспендируют в 1 мл буфера HCN, содержащего 1% Triton X 100.

Добавление детергента необходимо для высвобождения пула токсина, заключенного в мембранах. Также подготовьте параллельные наборы цитозольной и органеллярной фракций для контрольного эксперимента с целью подтверждения точности процедуры фракционирования; ресуспендируйте цитозольную фракцию в 20 µL четырехкратного буфера для образцов, а органеллярную фракцию — в 120 µL однократного буфера для образцов. Разделите эквивалентные объемы каждой фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и проведите анализ методом вестерн-блоттинга, чтобы продемонстрировать распределение цитозольного белка в супернатанте и растворимого резидентного белка ЭПР в осадке. Для подготовки слайда SPR сначала установите в прибор SPR золоченое стеклянное основание с самоорганизующимся монослоем.

Активируйте сенсорный слайд, проводя перфузию раствора E-D-C-N-H-S над слайдом в течение 10 минут со скоростью потока 41 µL/мин. Для всех последующих перфузий используйте ту же скорость потока. Удалите буфер для активации E-D-C-N-H-S, промывая планшет в течение пяти минут раствором PBS, содержащим 0.05%2020.

Теперь планшет содержит реактивные связи MI благодаря снятию защитных групп раствором E-D-C-N-H-S. Затем в течение 15 минут проведите перфузию антитела к CTA через активированный сенсорный слайд в разведении 1:20 000 в 20 мМ растворе ацетата натрия. В связи с изменением pH будет наблюдаться первоначальное падение показателя преломления, обозначаемого как RIU.

За этим последует увеличение RIU по мере захвата антител амидными реактивными связками. Удалите несвязавшиеся антитела с сенсорного слайда путем промывки PBST в течение пяти минут. Сигнал RIU, создаваемый захваченными антителами, выйдет на плато и стабилизируется, обеспечивая новый базовый сигнал.

В качестве завершающего этапа подготовки предметного стекла в течение пяти минут ПРОПУСТИТЕ через сенсорный чип 1 M этаноламин. Это позволит блокировать и инактивировать любые несвязанные линкеры, оставшиеся на поверхности сенсора. Сигнал RIU вырастет; для установления базовой линии в течение пяти минут пропускайте PBST через сенсор, покрытый антителами.

Затем в течение 300 секунд пропускайте через сенсор экспериментальный образец или стандарт токсина. Удалите лиганд из буфера и в течение следующих 200 секунд пропускайте через сенсор PBST. Любой токсин, оставшийся связанным с сенсором, удаляется путем 102-й промывки PBST при pH 5.0.

Это вернет сигнал к исходному базовому значению, что позволит обработать другой образец на том же датчике. Перед загрузкой нового образца пропустите небольшое количество воздуха через петлю для образца, чтобы удалить остатки жидкости из предыдущего образца. После сбора данных.

Данные можно проанализировать с помощью программного обеспечения scrubber two, а для подготовки графиков можно использовать программное обеспечение Igor. Пертуссин является AB-токсином, который перемещается с поверхности клетки в ЭПР перед тем, как его α-цепь проникнет в цитозоль.

Метод анализа транслокации на основе SPR позволил обнаружить PTs в цитозоле интоксицированных клеток CHO. Сигнал от цитозоля неинтоксицированных клеток отсутствовал, что подтвердило отсутствие перекрестной реактивности антител к компонентам цитозоля клетки-хозяина.

Фракция цитозоля из клеток, подвергнутых интоксикации в присутствии фелдена. А также не дала положительного сигнала; BFA предотвращает транспорт токсина к месту транслокации в ЭР и, следовательно, доставку H-цепи в цитозоль. Chole toin является другим транслокирующим в ЭР токсином типа AB.

Субъединица CTA1 была обнаружена в цитозольной фракции клеток HeLa, обработанных CT. Это подчеркивает, что данная методика работает с различными типами клеток и может быть применена к любому токсину, для которого доступны антитела к соответствующей цепи. Сигнал не обнаруживался при пропускании цитозольной фракции из клеток, обработанных CT, через SPR-сенсор, покрытый антителами к CTB, что демонстрирует тот факт, что, в отличие от субъединицы CT A1, связывающийся с клеткой пентамер CTB не проникает в цитозоль.

После продувки SPR-сенсора, покрытого антителами к CTA. Сигнал от органеллярной фракции выходит за пределы шкалы по сравнению с более слабым сигналом от цитозольной фракции. Это согласуется с известной низкой эффективностью транспорта CT к сайту транслокации в ЭПР, что, в свою очередь, ограничивает количество токсина, способного попасть в цитозоль.

Также можно отслеживать зависимое от времени накопление транслоцированного цитозольного токсина. После воздействия CT на клетки при температуре 4 °C токсин не обнаруживался в цитозоле через 15 минут после нагрева до 37 °C.

Небольшое количество цитозольного токсина было обнаружено через 30 минут при 37 °C, а после 45- и 60-минутных интервалов вымывания обнаруживались все более значительные количества цитозольного токсина. Это свидетельствует о непрерывной долгосрочной доставке ассоциированного с клеткой токсина в цитозоль. Данный анализ также позволяет обнаружить ингибирование транслокации токсина в цитозоль; клетки, обработанные 10% DMSO, демонстрировали низкие уровни цитозольного CT1 по сравнению с необработанными интоксикационными контрольными клетками, что указывает на нарушение разворачивания токсина.

Развертывание цепи является необходимым условием для транслокации в цитозоль, поэтому индуцированная DMSO стабилизация CT A1 соответствующим образом предотвратила ее перемещение из ЭПР в цитозоль. Для количественной оценки блокирования транслокации токсина под действием DMSO использовали стандартную кривую, построенную по известным концентрациям токсина, чтобы рассчитать концентрацию cta1 в цитозоле, которая составила 0,3 нг/мл для необработанных клеток и 0,1 нг/мл для клеток, обработанных DMSO. Таким образом, ингибирование развертывания CT A1 с помощью DMSO привело к трехкратному снижению транслокации CTA1 из ЭПР в цитозоль.

После выполнения данной процедуры мы сможем использовать другие методы, такие как анализы на токсичность, чтобы установить прямую связь между количеством токсина в цитозоле и его активностью.