Оценка Тератогенные Изменения в модели данио рерио внутриутробного развития плода алкоголь

Общая цель данной процедуры заключается в изучении влияния воздействия этанола на развитие зебраданио. Это достигается путем предварительного воздействия на зебраданио доз этанола в обычной воде для эмбрионов на ранних стадиях развития. Затем этанол удаляют, и рыбам дают развиваться до нужного временного интервала.

Затем в обработанных эмбрионах по сравнению с контрольными анализируют как общие физические изменения, так и изменения в экспрессии генов. В завершение эмбрионы подвергают воздействию мРНК, морфолино или препаратов, чтобы определить, можно ли изменить вызванные этанолом дефекты развития. В конечном итоге сочетание количественной ПЦР и гибридизации in situ показывает, что воздействие этанола на развивающиеся эмбрионы данио-рерио связано с изменением экспрессии генов.

Последующее манипулирование уровнями экспрессии генов может улучшить состояние или предотвратить развитие дефектов развития, вызванных этанолом. Методы, которые мы демонстрируем сегодня, расширяют наши знания о природе фетального алкогольного синдрома, а также позволяют изучить консервативные процессы развития у позвоночных. Сегодня Стеф Эрхардт, техник моей лаборатории, продемонстрирует способ обработки эмбрионов этанолом.

Выращивайте эмбрионы, полученные от скрещивания особей дикого типа, до стадии купола при температуре 28 °C в воде для эмбрионов. Распределите эмбрионы из одной кладки по нужному количеству чашек, помещая от 10 до 50 эмбрионов в каждую. Добавьте к эмбрионам раствор этанола в концентрации от 0,2 до 2,5% по объему в воде для рыб и верните их в инкубатор на срок до 24 часов после завершения требуемого времени воздействия.

Замените этанол с водой на свежую воду для эмбрионов на определенном этапе развития для сбора мРНК для количественной ПЦР. Поместите соответствующих по размеру эмбрионов в микропробирки типа «эппендорф». Удалите воду из пробирок и добавьте лизирующий буфер с TCEP.

С помощью моторизованного измельчителя физически диссоциируйте эмбрионы, затем поместите их в центрифугу для медленного центрифугирования. Перенесите раствор в колонку для предварительной очистки, после чего центрифугируйте колонку. Это необходимо для удаления крупных диссоциированных фрагментов.

Используйте набор для выделения РНК для экстракции РНК. Затем синтезируйте кДНК стандартными методами для количественной ПЦР или микрочипового анализа, чтобы подготовить эмбрионы к гибридизации in situ и иммуногистохимическому окрашиванию. Фиксируйте эмбрионы в возрасте от 6 до 24 часов после оплодотворения в 4% параформальдегиде в течение ночи при 4 °C, после трехкратной промывки в PBS с добавлением 0,1% Tween.

Удалите хорион с помощью двух острых пинцетов под микроскопом. Затем перенесите эмбрионы в метанол, используя серию замен жидкости с постепенным увеличением концентрации метанола и снижением концентрации PBT. После переноса эмбрионов в 100% метанол храните их при температуре -20 °C для окрашивания хряща.

Выращивайте эмбрионы до пяти или шести дней после оплодотворения. Фиксируйте их в течение ночи в 4% параформальдегиде при температуре четырех градусов Цельсия. Затем промойте их трижды в PBT, чтобы определить, какие уровни экспрессии генов изменились в результате воздействия этанола.

Проведите количественную ПЦР (кПЦР), начав с разработки праймеров и их последующей валидации. Протестируйте их на трех биологических образцах. Эти контрольные биологические образцы могут быть любого возраста, при условии, что интересующий ген экспрессируется в данном конкретном возрасте.

После проверки праймеров используйте ранее подготовленную кДНК для проведения количественной ПЦР; образцы анализируют в трех повторностях, включая контрольный образец. В качестве контроля для zebrafish мы используем праймеры к gap dh. Нормализуйте результаты по уровням gap DH. Затем рассчитайте относительный уровень экспрессии генов с помощью метода 2⁻ΔΔCt.

Вариант метода 2^-ΔΔCT, отображающий разницу между экспериментальной группой и диким типом. В пункте C представлены две гибридизационные конструкции. Меченые рибозонды к исследуемому гену.

Затем инкубируйте их с эмбрионами того же возраста в стандартных условиях и определите характер гибридизации с помощью щелочной фосфатазы; визуализируйте образцы с помощью стереомикроскопа для оценки морфогенетического развития, например, формы тела; визуализируйте живых эмбрионов для оценки межглазного расстояния и длины тела. Сначала зафиксируйте эмбрионы в параформальдегиде. Затем получите изображения для изучения влияния воздействия алкоголя на развивающиеся хрящевые структуры в окрашенных личинках.

Зафиксируйте эмбрионов zebrafish с помощью lc и blue в течение нескольких часов или в течение ночи для детекции и просветления эмбрионов перед визуализацией. Проанализируйте гибель клеток в живых эмбрионах путем их инкубации в растворе aine orange в PBS в концентрации 5 mg/mL в течение одного часа. Промойте эмбрионы трижды в PBS, затем закрепите их на предметных стеклах, получите изображения образцов с помощью конфокального микроскопа и используйте Z-стеки для создания композитных изображений.

После выявления генов, экспрессия которых снизилась под воздействием этанола, введите от 25 до 200 пг/нл кэпированной мРНК интересующего гена в эмбрионы на стадии одной или двух клеток. Поместите икринки в термостат при температуре 28 °C до достижения ими стадии купола, после чего подвергните их воздействию этанола, как описано ранее. Для генов, экспрессия которых увеличилась в результате воздействия этанола, проведите нокдаун путем введения антисмысловых морфолино в количестве от пикограмм до нанограмм в эмбрионы на стадии одной или двух клеток.

Данный протокол аналогичен протоколу для кэпированной мРНК. При инъекции мРНК или сплайсинг-морфолино используйте ОТ-ПЦР для измерения эффективности, сравнивая количество сплайсированных и несплайсированных транскриптов для анализа дозозависимой активности гена; титруйте вводимый морфолино и дайте эмбрионам развиться до нужной стадии перед воздействием этанола. Воздействие этанола на эмбрионы Danio rerio приводит к ряду нарушений развития и генетических дефектов, которые сопоставимы с фенотипами, наблюдаемыми у других позвоночных.

Аномальное развитие осевых тканей, включая Noor, приводит к укорочению и в некоторых случаях к разрыву noord, что частично вызывает последующие отклонения в развитии сомитов, показанные здесь. В то время как у необработанных контрольных образцов наблюдается выраженная шевроноподобная форма, сомиты, подвергнутые воздействию этанола, приобретают U-образную форму, характерную для снижения передачи сигналов sonic hedgehog. Как показано здесь.

Другим последствием воздействия этанола, возможно, развивающимся вследствие задержки раннего развития и последующих дефектов Ноора, является сокращение длины эмбриона. Этот результат схож с сохраняющимся периодом препубертата и низким ростом, наблюдаемыми у детей, подвергавшихся воздействию этанола во время развития, что свидетельствует о релевантности модели zebrafish для понимания данного человеческого врожденного порока развития. На моделях животных было продемонстрировано, что сильное воздействие этанола приводит к выраженным фенотипам фетального алкогольного синдрома, включая synthia и opia.

У зебрадани расстояние между глазами (IOD) уменьшается дозозависимым образом в зависимости от концентрации этанола, что согласуется с характером врожденного дефекта у людей. Опия наблюдается только при очень высоких дозах, однако более низкие дозы вызывают значительное сокращение IOD, что указывает на наличие в данной животной модели аналогичного дефекта развития срединных структур лица. На этом рисунке сравниваются уровни ранней экспрессии генов six3b и gli1 в эмбрионах, не подвергавшихся воздействию этанола, и эмбрионах, обработанных этанолом.

Оба гена продемонстрировали снижение уровней экспрессии в образцах, обработанных этанолом. С помощью двухцветной гибридизации были проанализированы паттерны экспрессии six3b и gooID, как показано на изображениях. Здесь оба гена показали снижение пространственной экспрессии в эмбрионах, обработанных этанолом, по сравнению с необработанным контролем.

Поскольку оба гена экспрессируются в тканях, которым предстоит стать тканями срединной линии черепа и лица C, их снижение через восемь часов после оплодотворения согласуется со снижением IOD на более поздних стадиях развития. После идентификации генов, на которые влияет этанол, становятся доступны механизмы, позволяющие увеличить или уменьшить их экспрессию. В данном примере была проведена инъекция мРНК sonic hedgehog — лиганда, повышающего уровни glee one, что позволило устранить грубые дефекты, вызванные снижением glee one в эмбрионах, подвергнутых воздействию этанола.

Инъекция six three B, однако, не смогла восстановить фенотип, вызванный воздействием этанола. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как исследовать генетические и This developmental дефекты, вызванные этанолом в развивающемся эмбрионе zebrafish. Методы, использованные здесь, также могут быть применены теми, кто хочет изучить токсичность других водорастворимых соединений для развивающегося эмбриона позвоночных.