Аналитические методы пробирного азотной окиси биоактивность

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать, как точно и специфично определять метаболиты оксида азота в биологических образцах. Это достигается путем предварительной обработки образцов крови сразу после сбора для предотвращения потери метаболитов или образования артефактов. Одновременно с этим проводится быстрый и эффективный забор тканей, чтобы минимизировать влияние гипоксической среды на метаболиты оксида азота.

Кольца аорты собирают и подвешивают в органо-камере для оценки их эндотелиальной функции. Кроме того, используются биохимические анализы для количественного определения уровней нитратов, нитритов, а также относительных уровней нитротиолов и других нитросодержащих продуктов в ткани. С помощью этих анализов надлежащее сравнение экспериментальных и контрольных животных позволяет получить ценную информацию о продукции и метаболизме оксида азота.

Основным преимуществом использования этого многосистемного подхода по сравнению с одиночными методами или анализами является возможность получения более полной картины биохимии оксида азота в нескольких системах органов. Таким образом, мы можем начать понимать, какие из этих метаболитов могут иметь прогностическую или диагностическую значимость и как репертуар метаболитов оксида азота отражает образование и доступность эндотелиального оксида азота. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как каждый этап процесса критически важен для сохранения целостности образца.

Некоторые из этих этапов не очевидны при чтении раздела «Методы» в типичных научных журналах из-за детального характера сбора образцов и экстракции тканей. Данную процедуру продемонстрирует доктор Hong Jing, старший научный сотрудник моей лаборатории. Для выполнения этого протокола подготовьте человека или лабораторное животное для забора крови; в случае с лабораторными животными также будет проведен анализ тканей.

Сначала соберите цельную кровь, введя иглу калибра 25G в нижнюю полую вену. После сбора от 500 до 1000 µL проведите перфузию животного для удаления остатков крови, вводя физиологический буфер через верхушку левого желудочка, и дождитесь полного замещения крови, пока кровь и буфер выходят через нижнюю полую вену. Венозную кровь следует собирать в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл, содержащие NEM и EDTA, непосредственно после забора.

Центрифугируйте кровь при 14 300 RCF в течение семи минут. С помощью пипетки аспирируйте плазму с осадка эритроцитов и перенесите ее в отдельную пробирку. Подготовьте изолированные образцы плазмы для ВЭЖХ, добавив равный объем холодного метанола к 50 µL собранной плазмы.

Интенсивно перемешивайте смесь на вортексе от трех до пяти секунд до появления помутнения. Затем центрифугируйте смесь при 14 300 RCF в течение семи минут. Для осаждения белков плазмы перенесите супернатант в отдельную пробирку объемом 1,5 мл и храните при температуре 4 °C до проведения анализа.

Для подготовки плазмы к хемилюминесцентному анализу возьмите оставшийся объем плазмы, который должен составлять примерно от 200 до 400 µL, и разделите его на две равные части. Подготовьте одну часть плазмы, добавив 10% объема 5% подкисленного сульфида, и подождите 10 минут. Теперь данный образец готов к ХЛД-анализу.

Подготовьте вторую половину плазмы, добавив через пять минут 10% объема 2% раствора хлорида ртути. При комнатной температуре добавьте 10% объема подкисленного сульфонамида. Подождите еще 10 минут и введите этот образец в CLD аналогично плазме.

Осадок эритроцитов можно подготовить для ВЭЖХ и CLD для любого из этих видов анализа. Начните со смешивания одной части клеточного осадка с четырьмя частями гипотонического лизирующего раствора. Для анализа CLD тщательно перемешайте смесь на вортексе.

Подготовка клеток проводится так же, как и для плазмы. Начните с добавления равного объема метанола. Затем интенсивно перемешайте смесь на вортексе в течение трех-пяти секунд, после чего центрифугируйте ее в течение семи минут при 14 300 RCF.

Теперь отпипетируйте супернатант и храните его при температуре four degrees Celsius до проведения анализа методом HPLC для определения уровней метаболитов оксида азота в тканях. При работе с интересующими тканями экспериментальных животных следует сначала отобрать и подготовить кровь, как описано в предыдущем разделе; забор тканей необходимо проводить стандартным образом, уделяя особое внимание скорости и эффективности, чтобы избежать развития гипоксии в тканях. После сбора гомогенизируйте образцы тканей в соотношении один к пяти с использованием PBS, содержащего N-E-M-E-D-T-A.

Затем подготовьте гомогенизаты тканей для анализа методами ВЭЖХ и ХЛД, как было описано в предыдущих разделах для эритроцитов. После анестезии взрослой мыши диэтиловым эфиром и подтверждения отсутствия реакции на укол в пальце лапы проведите торакотомию. Выполните срединный разрез от грудины до области лобка, чтобы открыть грудную и брюшную полости.

Затем проведите перфузию животного оксигенированным буфером Кребса-Хейлита. Используйте шприц с иглой 25G для введения буфера в верхушку левого желудочка. При этом правое предсердие должно быть рассечено для обеспечения оттока крови.

После перфузии изолируйте брюшную аорту, иссекая и удаляя печень, легкие и другие ткани, которые могут ее перекрывать. Затем зажмите сердце пинцетом и аккуратно отделите аорту от задней стенки тела животного. Поместите сердце и аорту в чашку Петри со льдом.

Поместите в чашку холодный буфер Кребса. Осторожно иссеките и удалите жировую ткань и адвентицию с аорты. При очистке избегайте повреждения эндотелия внутри сосуда.

Чтобы предотвратить гипоксию, поддерживайте низкий уровень метаболизма аорты, перенося ее в свежий ледяной оксигенированный буфер каждые пять минут. Теперь с помощью скальпеля разрежьте аорту на кольцевидные сегменты длиной 3 мм. Перенесите сегменты в четырехканальную камеру для тканей и органов объемом 10 мл, заполненную оксигенированным буфером Кребса.

С помощью ручки преобразователя создайте предварительное натяжение 1,5 грамм для каждого кольца аорты. Согласно эмпирическим данным, 1,5 грамм является оптимальным начальным натяжением для обеспечения надлежащей вазомоторной функции.

Используя восьмиканальный октальный мост и программное обеспечение для сбора данных, контролируйте и регистрируйте измерение силы в мышином препарате; дайте кольцам стабилизироваться в течение 80 минут, меняя буфер каждые 20 минут, после чего приступайте к эксперименту. После стабилизации натяжения ткани добавьте 100 nanomolar феннерина в каждое кольцо для достижения субмаксимального сокращения. Как только натяжение кольца стабилизируется и установится постоянный уровень тонуса, проведите анализ зависимости «доза-эффект» в ответ на воздействие эндотелиального агониста, такого как ацетилхолин.

Это позволит определить продукцию оксида азота и степень релаксации сосудов. После проведения кривой «доза-ответ» на ацетилхолин промойте ванны буфером Кребса и добавьте в каждую ванну с органом 100 нМ феннирина для сокращения сосудов. Затем повторно определите чувствительность колец гладкой мышцы к экзогенному источнику оксида азота, такому как нитропруссид натрия, в присутствии и отсутствии ODQ — ингибитора растворимой гуанилатциклазы.

Данный подход позволит определить значение 100% релаксации сосудов, а также продемонстрирует ключевую роль растворимой гуанилатциклазы в опосредовании ответа на оксид азота при вазорелаксации. Поскольку ODQ предотвращает релаксацию, вызванную нитропруссидом натрия в ответ на ацетилхолин, кольца аорты здоровых мышей контрольной группы релаксировали, в то время как кольца аорты мышей с эндотелиальной дисфункцией показали снижение релаксации из-за уменьшения продукции оксида азота. Для животных контрольной группы также были проведены специфические анализы на денитрозирование с использованием хемилюминесценции нитритов.

RSNO и RNNO были обнаружены с помощью анализа восстановительного денитрозилирования. Путем вычитания площадей пиков измеряли уровни нитрита и r sNO. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии оксида азота и сосудов, такие как: каким образом циркулирующие уровни этих метаболитов оксида азота отражают их уровни в тканях и как меняются метаболиты при различных патологических состояниях?

Определение стационарных концентраций и периода полувыведения этих соответствующих метаболитов оксида азота в различных органах и во всей системе кровообращения одного животного позволит выявить специфические молекулярные признаки патологических процессов и поможет нам определить новые методы лечения на основе оксида азота, что обеспечит клинициста более точными биомаркерами тяжести или прогрессирования заболевания. Как правило, специалисты, только начинающие работу в области изучения оксида азота, сталкиваются с трудностями, так как многие методы недостаточно чувствительны для обнаружения и количественного определения низких уровней метаболитов оксида азота, содержащихся в биологических образцах. Прежде всего, отсутствие навыков в данной области, скорее всего, приведет к созданию артефактов в процессе обработки образцов, что повлечет за собой появление ошибочных данных и их неверную интерпретацию.