Количественные Визуализация Lineage конкретных Toll-подобный рецептор-опосредованной сигнализации в моноцитах и ​​дендритных клеток из малых образцов крови человека

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать использование технологии потоковой цитофлуориметрии с визуализацией (image stream technology) для количественного анализа клеточных механизмов первичных иммунных клеток из четко определенных когорт пациентов. Это достигается путем первоначального выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК) из образцов крови, полученных от пациентов или здоровых добровольцев. После выделения клетки активируют, а затем маркируют флуоресцентными метками.

Затем клетки подвергаются гидродинамическому фокусированию, возбуждаются лазерным излучением и визуализируются с помощью ПЗС-камеры с интеграцией по временной задержке. В завершение с использованием проточного цитометра с потоковой визуализацией регистрируются изображения и проводится количественное определение NF kappa b.

Транслокация на каждом клеточном изображении выполняется с помощью программного обеспечения ideas. В конечном итоге различия между каждой группой испытуемых могут быть определены путем анализа точечных диаграмм, гистограмм и изображений клеток. Преимущество потока изображений заключается в том, что он сочетает в себе данные проточной цитометрии и иммунофлуоресценции.

Мы можем изучать пути клеточной сигнализации с привязкой к конкретным клеточным линиям, как на уровне отдельных клеток, так и на уровне популяций, используя при этом лишь небольшой образец крови. Этот метод позволяет решать ключевые научные задачи путем локализации и количественного определения промежуточных звеньев передачи сигнала. Например, его можно применять для исследования опосредованного транслокации в ядро прозрачных факторов или для изучения влияния старения на биологию клетки.

Сотрудник моей лаборатории продемонстрирует технику после выделения мононуклеарных клеток периферической крови, полученных от добровольцев. Ресуспендируйте выделенные PBMC в концентрации 3×10⁶ клеток на 0,6 мл среды, затем перенесите клеточную суспензию в пробирки объемом 1,5 мл. Далее стимулируйте часть клеток активирующим агентом, таким как TLR8-агонист R848, показанный здесь, а затем инкубируйте все клетки при 37 °C в течение 10–60 минут в инкубаторе с 5% CO2.

По истечении периода инкубации центрифугируйте клетки в течение пяти минут при 500 ×g при комнатной температуре, удалите супернатант и проведите маркировку клеток коктейлем поверхностных антител, специфичных для моноцитарного ряда или дендритных клеток, в течение 20 минут при 4 °C, включая пробирки с клетками, маркированными одноцветными конъюгатами для использования в качестве контролей компенсации. Затем зафиксируйте клетки в 4% PFA в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугирования клеток в течение 10 минут при 500 ×g при комнатной температуре ресуспендируйте PBMC в буфере для замораживания и храните клетки при -80 °C до проведения анализа в день проведения анализа.

Быстро разморозьте клетки на водяной бане при 37 °C, затем центрифугируйте для удаления буфера для заморозки и пермеизируйте их 100 µL буфера для промывки BD perm. Затем проведите маркировку антителами к внутриклеточным сигнальным компонентам, такими как антитела к NF kappa BP 65, показанные здесь, в течение 20 минут при комнатной температуре. После осаждения клеток путем центрифугирования ресуспендируйте их в 100 µL буфера для промывки BD perm, содержащего козий антикроличный IgG.

Добавьте Alexa 647 и инкубируйте PBMC еще в течение 20 минут при комнатной температуре. Непосредственно перед визуализацией окрасьте ядра клеток соответствующим красителем; начните с включения ImageStream, затем запустите программное обеспечение Inspire. Далее нажмите кнопку «load default template» и выберите «initialize fluidics».

Затем нажмите на меню галереи изображений и выберите «все» (all). Теперь нажмите «запустить настройку» (run set up), чтобы начать получение изображений микросфер, и выберите канал светлого поля. Когда микросферы будут в движении, нажмите «запустить все» (start all) во вкладке «помощник» (assist), чтобы откалибровать и протестировать прибор.

После калибровки системы ImageStream нажмите кнопку «flush, lock and load», чтобы загрузить в прибор образец с максимальной яркостью. Затем установите мощность лазера таким образом, чтобы максимальное значение пикселей для каждого флорохрома составляло от 104 000 отсчетов, согласно измерениям на точечных диаграммах. После этого определите критерии классификации клеток.

Теперь нажмите «Run» (Запуск), а затем «Acquire» (Сбор данных), чтобы собрать и сохранить файл с данными эксперимента. Для анализа сначала откройте программное обеспечение для анализа данных. Создайте компенсированные файлы изображений, а затем выделите события (гейтирование) с нормальной интенсивностью окраски ядерного красителя и высоким аспектом соотношения ядерного красителя. Чтобы отличить одиночные клетки в гейте R1 от клеточного дебриса или многоклеточных агрегатов, моноциты определяются в гейте для CD14-положительных клеток; миелоидные дендритные клетки, характеризующиеся высоким уровнем CD11c и низким уровнем маркеров CD4 и lin1, находятся в гейте R3.

В завершение используйте программное обеспечение Ideas для определения колокализации цитоплазматического транскрипционного фактора NF kappa B с ядерным красителем. Высокая корреляция NF kappa B и ядерного красителя, указывающая на колокализацию двух маркеров, отражается в высоком показателе сходства и свидетельствует о степени активации клетки. Для оценки относительной функциональной эффективности клеток в различных группах лечения или популяциях пациентов можно сравнить процент событий с высоким показателем сходства.

Затем с помощью программного обеспечения можно отобразить изображения клеток из ключевых сегментов гистограмм популяций. ImageStream позволяет осуществлять гейтирование подмножеств клеток непосредственно из pbmc и визуализировать клеточный ответ в гейтированных, но не сортированных популяциях клеток. В данном случае в исходном состоянии количественно оценивали влияние сигналинга TLR на ядерную локализацию NF kappa BP 65 в myeloid dcs с фенотипом lin one-отрицательным, CD four-dim и CD 11 C-положительным.

В большом проценте нестимулированных клеток наблюдалось присутствие транскрипционного фактора NF kappa BP 65 в цитоплазме. Было установлено, что после стимуляции обработанные клетки характеризуются значительно более высоким показателем коинциденции (similarity score) NF Kappa BP 65 с ядерным красителем PI, что указывает на транслокацию NF Kappa BP 65 в ядро после стимуляции. Цифровые изображения, полученные одновременно для популяций необработанных и стимулированных R 8 48 клеток, демонстрируют репрезентативные клетки и интенсивность транслокации NF kappa B в ядро клетки. Обратите внимание на более высокую интенсивность окрашивания NF Kappa B и PI в группе, стимулированной R 8 48, по сравнению с необработанными клетками.

Мы применяли этот метод к клеткам доноров разного возраста и выявили различия в путях активации NF kappa B, опосредованных TLR. После освоения данной методики процедура может быть выполнена за один день, не считая времени на анализ изображений, что позволяет получить как несколько изображений локализации, так и статистику по популяции. Кроме того, мы можем визуализировать ответы непосредственно от нескольких популяций клеток без их физического разделения. Метод Image stream может быть широко применен к ряду клеточных механизмов и должен стать очень ценным инструментом в трансляционных исследованиях.