TransFLP - метод генетической модификации

Целью данной процедуры является генетическая манипуляция vio cray с использованием этого быстрого и эффективного метода, основанного на естественной трансформации и комбинации flip. Это достигается путем предварительного подготовки подходящего источника хитина, так как хитин является естественным индуктором трансформации. На втором этапе создается ДНК-конструкция с помощью двух раундов ПЦР, после чего проводится естественная трансформация, позволяющая бактериям, содержащим плазмиду PBR flip, поглотить ПЦР-фрагмент и включить его в свои геномы.

Затем используется повышение температуры для индукции экспрессии кодируемой плазмидой липазы, которая необходима для удаления кассеты антибиотикорезистентности, фланкированной сайтами рекомбинации flip (FRT). На заключительном этапе из бактерий удаляют плазмиду, кодирующую FLP-рекомбиназу. В конечном итоге для подтверждения успешности генетической манипуляции применяют ПЦР и секвенирование.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как использование суицидальных плазмид для генетических манипуляций с виресом, является его высокая скорость и эффективность. Начните с навешивания образцов хитиновых хлопьев массой от 50 до 80 мг в стандартные пластиковые пробирки объемом 1,5 мл; затем, оставив крышки пробирок открытыми, подвергните хлопья автоклавированию. Сразу после завершения цикла автоклавирования плотно закройте крышки и храните набор автоклавированных хлопьев при комнатной температуре. Для амплификации интересующих участков ДНК, а также антибиотикорезистентной кассеты, фланкированной сайтами FRT, методом ПЦР требуется как минимум шесть олигонуклеотидов. Также рекомендуется использовать пару олигонуклеотидных праймеров, расположенных за пределами вставленного ПЦР-фрагмента.

Это позволяет проверить интеграцию и правильное вырезание кассеты с антибиотикорезистентностью, фланкированной сайтами FRT. Олигонуклеотиды номер два, номер три, номер четыре и номер пять следует подготовить с осторожностью. Праймеры два и пять должны содержать не менее 28 пар оснований, чтобы обеспечить достаточный отжиг к геномной ДНК. Праймеры три и четыре следует сконструировать, используя в качестве матрицы плазмиду, содержащую FRT. Спроектируйте праймеры два и пять таким образом, чтобы обеспечить обширное комплементарное спаривание оснований на 5'-конце между праймерами два и три, а также между праймерами четыре и пять соответственно.

Теперь для первого раунда ПЦР используйте олигонуклеотиды один и два, чтобы подготовить первую из трех одновременных, но независимых ПЦР-реакций для амплификации вышележащего участка интересующей экспериментальной области специально разработанных конструкций. Параллельно подготовьте вторую ПЦР-реакцию, используя олигонуклеотиды три и четыре, для амплификации антибиотиковой кассеты, фланкированной сайтами FRT. Например, в данном эксперименте использовался ген A PH, кодирующий устойчивость к канамицину.

Одновременно амплифицируйте нижележащий участок ДНК, подготовив третью реакцию ПЦР с использованием олигонуклеотидов пять и шесть и геномной ДНК в качестве матрицы. Затем запустите ПЦР-реакцию для всех трех образцов. После очистки всех трех ПЦР-фрагментов используйте смесь с равными количествами всех трех фрагментов, полученных в первом раунде, в качестве матрицы для проведения второго раунда ПЦР. Эта амплификация будет катализирована олигонуклеотидами один и шесть.

Полученный ПЦР-фрагмент будет использоваться в качестве трансформирующей ДНК в экспериментах по естественной трансформации. После выращивания клеток v cholera в аэробно обогащенной среде при 30 °C соберите бактерии путем центрифугирования при комнатной температуре.

Затем перенесите бактериальную культуру на хитин в хлопьях и инкубируйте клеточную суспензию в течение ночи при 30 °C. Далее осторожно добавьте не менее 200 нг фрагментов, полученных в результате второго раунда ПЦР, в бактериальную клеточную суспензию. Следя за тем, чтобы бактерии не отделялись в большом количестве от поверхностей хитина, инкубируйте данный раствор при 30 °C в неподвижном состоянии еще один день.

Теперь интенсивно перемешайте культуру на вортексе в течение не менее 30 секунд. Для бактерий, несущих плазмиду PBR flip, распределите от 100 до 300 µL клеточного раствора на двойные селективные чашки с ампициллином и другим антибиотиком. Инкубируйте культуры бактериальных клеток при 30 °C до появления видимых колоний. Затем изолируйте отдельные трансформанты с селективных чашек.

Начните этот этап с выращивания бактерий на чашках с LB-агаром, содержащим ампициллин, при 37 °C в течение 16–24 часов. В качестве дополнительного шага можно изменить температуру до 40 °C на два-три часа, так как экспрессия flip из плазмиды PBR flip снимается с репрессии при более высоких температурах. После еще восьми часов инкубации при 37 °C перенесите бактерии на свежие чашки.

Теперь проведите параллельный рестрикционный анализ клонов на агариковых пластинах с антибиотиком и без него, чтобы проверить чувствительность к антибиотику, а затем изолируйте одну полученную чувствительную к антибиотику колонию. Начните этот этап с выращивания культуры в течение ночи в аэробных условиях при 30 °C в обогащенной среде без антибиотиков. На следующее утро вырастите новую культуру в течение трех-шести часов, разбавив ночную культуру в соотношении 1:100 в свежей среде без антибиотиков; во второй половине дня проведите посев или высев разведения культуры на обычные чашки с LB-агаром, а затем инкубируйте пластины еще 8–16 часов при 30 °C до появления видимых колоний.

В этом первом эксперименте ставилась цель делеции соседних генов CTXA и CTXB. Олигонуклеотиды для метода trans flip были созданы так, как было продемонстрировано ранее; родительский штамм, промежуточный штамм, содержащий кассету антибиотикорезистентности, фланкированную сайтами FRT, вместо исходного локуса ДНК C-T-X-A-B, и финальный штамм с делецией C-T-X-A-B и без кассеты резистентности были протестированы на генотип. Для этого эксперимента была проведена ПЦР с использованием праймеров, которые отжигались не на трансформирующем ПЦР-фрагменте, а только на хромосомной ДНК. ПЦР-фрагменты разделяли методом стандартного гель-электрофореза для определения их размера.

В первой дорожке штамм холеры типа B был обнаружен при ожидаемом размере фрагмента 3 143 п. н. Во второй дорожке ПЦР-фрагмент, полученный от штамма delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT, находился на отметке 3 162 п. н.

В третьей дорожке фрагмент delta ctx A B FFR TP CR располагался на уровне 1 769 пар оснований по сравнению с маркером 1 кБ. Во втором примере, в котором удалялся целый геномный остров, в качестве мишени для данного эксперимента был выбран островок патогенности Vibrio 1 или VPI 1. Метод trans-flip был модифицирован в два этапа.

Сначала интеграция гена устойчивости к канамицину была осуществлена с использованием одного сайта FRT в начале острова патогенности (PI) один. Затем был проведен второй раунд естественной трансформации, что позволило вставить дополнительный маркер устойчивости к антибиотикам, а именно ген устойчивости к гентамицину, за которым следует второй сайт FRT в конце острова патогенности. Соответствующие пары праймеров указаны над каждым изображением геля, и метод trans FLP продолжали выполнять так, как было продемонстрировано выше.

Родительский, промежуточный и конечный штаммы были подтверждены с помощью ПЦР очищенной геномной ДНК в первой дорожке. ПЦР-фрагмент дикого типа штамма V cholera был нанесен на вторую дорожку. Был нанесен ПЦР-фрагмент, полученный от штамма VPI one FRT can GM FRT.

В третьей дорожке был проанализирован ПЦР-продукт, полученный из штамма delta VPI one FRT. Пары праймеров указаны над каждым изображением геля. В конечном штамме отсутствует весь VPI one.

В этом третьем примере последовательность T7 РНК-полимезависимого промотора была интегрирована выше гена Tfox, основного регулятора естественной трансформации, с использованием метода trans flip с небольшим модификацией стандартного протокола. Консенсусная последовательность T7 РНК-зависимого промотора была включена в виде навесов в олигонуклеотиды номер четыре и номер пять, чтобы эта последовательность ДНК сохранилась в хромосоме. После эксцизии кассеты с антибиотикорезистентностью полученная конструкция была интегрирована в штамм V colorized, содержащий T7 РНК-полимеразу.

В данном штамме экспрессия гена Т7 РНК-полимеразы управлялась промотором LAC UV5 для проверки Т7 РНК-полимеразно-зависимой экспрессии T Fox. Анализы естественной трансформации проводились в среде LB. Родительский штамм, в котором отсутствует Т7-зависимый промотор перед геном T Fox, не подвержен естественной трансформации в этих условиях из-за отсутствия транскрипции T FOX в богатой среде и в отсутствие его природного индуктора — хитина. Данный фенотип не зависел от того, индуцировалась ли Т7 РНК-полимераза искусственно с помощью IPTG или нет.

Однако штамм, полученный в результате инверсии trans, который содержит зависимый от T7 РНК-полимеразы промотор выше по течению от гена компетентности T FOX, действительно был способен к естественной трансформации в обогащенной среде из-за утечки промотора LAC UV five в среде LB. Синтезированная T7 РНК-полимераза транскрибировала T FOX с зависимого от T7 РНК-полимеразы промотора без индукции IPTG. Это инициировало естественную компетентность и трансформацию, подтвердив функциональность интегрированной последовательности зависимого от T7 РНК-полимеразы промотора.

Этот фенотип был значительно усилен при полной индукции Т7-РНК-полимеразы путем добавления IPTG — индуктора промотора lacUV5. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как генетически манипулировать V. cholerae, используя комбинацию хитин-индуцированной естественной трансформации и flip-рекомбинации. После освоения эта методика позволит вам делетировать гены или геномные островки, а также интегрировать последовательности ДНК сайт-специфичным образом всего за несколько дней.