Радиоактивный На месте Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении областей экспрессии конкретного гена, а также в определении времени и уровня этой экспрессии для более глубокого понимания функций гена. Это достигается путем быстрого сбора и подготовки ткани, используемой в процедуре, для сохранения ее целостности. Вторым этапом является обработка ткани с целью снижения уровня неспецифического связывания рибозондов.

Затем рибозонды гибридизируют с тканью и визуализируют связывание RIBA-зонда. С помощью рентгеновской пленки или светочувствительной эмульсии получают результаты, которые позволяют определить локализацию и уровень экспрессии генов на основе рентгеновских снимков или анализа методом темнопольной и светлой микроскопии. При использовании программного обеспечения Image J следует выполнить несколько критически важных этапов, на которых часто допускаются ошибки; одним из таких этапов является предотвращение появления фона.

Существует ряд факторов, которые могут привести к появлению фонового сигнала, таких как плохая сатурация или гибридизация при неправильной температуре. Еще одной причиной является контаминация РНК, которая приведет к деградации вашего РНК-зонда. Поэтому необходимо строго соблюдать условия отсутствия РНКаз.

В-третьих, при погружении предметных стекол в эмульсию необходимо убедиться в отсутствии утечек света в темной комнате или воздействия света на эмульсию на всех этапах этого процесса, который может длиться до трех недель. Эту методику продемонстрирует Хун Чэнь, постдок в моей лаборатории. После извлечения свежего мозга и промывки в 1× PBS зафиксируйте мозг в среде OCT tissue tech, погрузив его в форму с данной средой при комнатной температуре.

Убедитесь, что мозг ориентирован соответствующим образом для последующего секционирования. Затем, распылив этанол на сухой лед, заморозьте ткань, поместив блок в смесь этанола и сухого льда. Осторожно, чтобы этанол не попал внутрь блока, нарежьте замороженную ткань с помощью криостата на срезы толщиной от 10 до 12 мкм и перенесите их на предметные стекла Super Plus для тканей мозга и эмбриональных тканей.

Оптимальная температура среза находится в диапазоне от -18 °C до -20 °C. Храните срезы в кассете для предметных стекол при температуре -80 °C. Переносите предметные стекла из места хранения при -80 °C в металлическую стойку на сухом льду.

Затем, работая в сертифицированном вытяжном шкафу, поместите кассету в раствор 4% параформальдегида, предварительно нагретый до температуры на 3–5 °C выше комнатной. Инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре. После инкубации извлеките кассету из параформальдегида и промойте стекла, 15 раз погрузив кассету в PBS. Повторите этот этап промывки дважды, каждый раз используя свежий раствор PBS.

Затем погрузите предметные стекла в свежеприготовленный буфер для ацетилирования на 10 минут, чтобы уменьшить неспецифическое связывание зонда RIBA. После этого промойте стекла, как и прежде, но в этот раз используйте в качестве промывочного раствора 2-кратный SSPE. Дегидратируйте ткань, пропуская через серию растворов этанола 70, 95 и 100% по две минуты в каждом растворе.

Затем высушите предметные стекла в вытяжном шкафу в течение минимум 10–15 минут. После синтеза зонда RIBA, согласно инструкциям в письменном протоколе, рассчитайте необходимый объем зонда RIBA и раствора для гибридизации для всех предметных стекол. Предварительно прогрейте смесь для гибридизации с Ribo-зондом при 65 °C в течение пяти минут.

Для денатурации Ribo-зонда перенесите пипеткой 100 microliters гибридизационного раствора Ribo-зонда и распределите его по поверхности покровного стекла. Затем с помощью второго покровного стекла равномерно распределите раствор по ткани и покровному стеклу. Поместите предметное стекло в металлическую стойку горизонтально лицевой стороной вверх; когда все стекла будут готовы, медленно погрузите стойку в масляную баню при температуре 65 degree Celsius на время от четырех до максимум 16 часов.

Масло создает герметичное уплотнение вокруг покровных стекол; после инкубации удалите излишки масла с металлической кассеты с предметными стеклами. Затем поместите кассету в стеклянный или металлический лоток с хлороформом в вытяжном шкафу. Повторите промывку во втором лотке со свежим хлороформом.

Затем погрузите кассету в раствор 0,1% β-меркаптоэтанола в этаноле и 2-кратном растворе SSPE, чтобы ослабить крепление покровных стекол и удалить избыток гибридизационного раствора. Затем перенесите предметные стекла во второй раствор свежего 0,1% β-меркаптоэтанола в этаноле и 2-кратном растворе SSPE. Переместите стекла без покровных стекол в новую кассету в кювете, содержащей 0,1% β-меркаптоэтанола в 2-кратном растворе SSPE; инкубируйте в этом растворе в течение одного часа при комнатной температуре для удаления избытка несвязанного РНК-зонда.

Затем перенесите кассету со стеклами в предварительно нагретый до 65 °C раствор 2×SSPE с добавлением 50% формымида, содержащий бета-меркаптоэтанол и этанол до конечной концентрации 0,1%, и инкубируйте при 65 °C в течение одного часа. После инкубации утилизируйте этот и все предыдущие водные промывочные растворы, а также покровные стекла как радиоактивные отходы. Затем дважды промойте стекла в предварительно нагретом до 65 °C растворе 0,1×SSPE по 30 минут каждый раз.

Затем обезвоживают ткань, используя серию растворов этанола с концентрацией 70%, 95% и 100% по две минуты в каждом растворе. В завершение высушивают предметные стекла в вытяжном шкафу в течение не менее 30 минут. Сначала необходимо определить, присутствует ли в ткани радиоактивный сигнал.

Поместите высушенные стекла в кассету для пленки, работая в темной комнате при безопасном освещении, и наложите рентгеновскую пленку поверх стекол. Убедитесь, что стекла обращены эмульсионным слоем пленки, и закройте кассету. Экспонируйте стекла на пленке от одного до семи дней, в зависимости от ожидаемого количества транскриптов.

После завершения экспозиции проявите рентгеновскую пленку в стандартном проявителе и фиксаже. Сигнал гибридизации будет выглядеть в виде черных областей на пленке, образовавшихся в результате экспонирования зерен серебра в эмульсии, что позволит определить клеточное разрешение и увидеть сигнал непосредственно на ткани. Слайды погружают в фотографическую эмульсию, а затем окрашивают контрастным красителем.

Если стекла подлежат докрашиванию кристаллическим фиолетовым, то срезы должны быть депарафинизированы согласно инструкциям в письменном протоколе. На этом этапе, работая в темной комнате, налейте дистиллированную воду в пробирку. Возьмите эмульсию uc NTB и разбавьте ее дистиллированной водой в соотношении один к одному.

После расплавления эмульсии на водяной бане при 42 °C в течение 20–30 минут перенесите её в стеклянный контейнер для погружения, помещенный в водяную баню при 42 °C на 20–30 минут. Уровень разбавленной эмульсии должен быть таким, чтобы при погружении в неё полностью покрывались все срезы на предметном стекле. При большом количестве стекол может потребоваться дополнительный объем эмульсии.

Теперь погрузите предметные стекла в разбавленную эмульсию в водяной бане при температуре 42 °C, после чего высушите стекла в закрытом светонепроницаемом контейнере в темной комнате в течение ночи или в термостате при температуре 37 °C от двух до трех часов при выключенном свете. После высушивания перенесите стекла в кассету для предметных стекол. Заклейте края черной изолентой, а затем оберните алюминиевой фольгой.

Храните кассеты при температуре 4 °C от нескольких дней до нескольких недель; перед проявлением доведите предметные стекла до комнатной температуры. Затем, работая в темной комнате, извлеките штатив с предметными стеклами из кассет и проявите их в проявителе Codec D-19 при температуре 16 °C в течение трех-пяти минут. После этого промойте проявленные стекла под проточной водой при комнатной температуре в течение одной минуты.

Затем дважды инкубируйте стекла в фиксирующем растворе при 19 °C по шесть минут каждое; во время второй инкубации в фиксаторе можно включить комнатный свет. Теперь промойте стекла под проточной водой при комнатной температуре в течение не менее 30 минут. Затем, пока стекло еще влажное, скребите лезвием бритвы эмульсию с его обратной стороны.

Наконец, проведите контрастирование 0,3% раствором кристалл-фиолетового, затем, при необходимости, дегидратируйте и зафиксируйте стекла в соответствии с инструкциями в письменном протоколе. Затем удалите излишки эмульсии с обратной стороны стекол, смочив их водой и соскоблив лишнее лезвием бритвы. Промойте стекла в 80% растворе ethanol и один или два раза осторожно протрите их, чтобы удалить частицы мусора и пыль.

Сделайте снимки при темнопольном или светлом освещении. Этапы соскабливания и очистки может потребоваться повторить два или три раза, чтобы получить качественные изображения без частиц пыли, которые легко заметны в темном поле под диссекционным микроскопом. Следующие изображения представляют собой примеры авторадиографии гибридизации in situ с рентгеновских пленок.

На этом рентгеновском снимке представлен сагиттальный срез всей головы эмбриона певчей птицы зебра-финца на 10-й день развития, гибридизированный с антисмысловым рибозондом к Fox P1. Черные экспонированные зерна на пленке указывают на экспрессию матричной РНК; как видно на снимке головного мозга, мРНК Fox P1 здесь обогащена в мезопаллиуме, стриатуме и дорсальном таламусе. На следующем рентгеновском снимке показан срез той же птицы зебра-финча, гибридизированный с антисмысловым рибозондом к Cupere.

TF two Co.TF two обогащен в области palam alium и более вентральной части таламуса. Следующие изображения представляют собой примеры авторадиографии гибридизации in situ на предметных стеклах с эмульсией. Данное изображение в темном поле, полученное с помощью диссекционного микроскопа, демонстрирует сагиттальный срез всей головы зебриковой канарее в возрасте шести дней после вылупления, который был гибридизирован с антисмысловым RIBA-зондом к Fox P one.

Белые проявленные зерна серебра в эмульсии над тканью указывают на экспрессию матричной РНК. Красный цвет соответствует окраске кристаллическим фиолетовым. Масштабная линейка соответствует одному миллиметру.

На данном изображении показан срез того же образца певчей птицы зебры-финича, которая была гибридизирована с антисмысловым рибозондом к coop TF two. Следующие изображения сравнивают антисмысловое и смысловое мечение, демонстрирующее различные паттерны на авторадиографиях рентгеновских пленок срезов головного мозга зебры-финича на 12-й эмбриональный день. Пунктирная линия обозначает контур всего мозга, а буква C отмечает мозжечок.

Видно, что антисмысловая цепь PAC six экспрессируется в головном мозге, особенно в вентрикулярной зоне. Смежный срез, гибридизированный со смысловой цепью pack six, не выявляет фоновой экспрессии в всей области головы эмбриона, однако наблюдается явная экспрессия в пигментном слое сетчатки, аналогично антисмысловой цепи. На следующих изображениях в C представлены два сигнала экспрессии генов и предметные стекла с эмульсией, взятые из мозга канареечного сечка на поздних стадиях эмбрионального развития, при рассмотрении в светлом и темном полях.

На этом изображении в светлом поле показана экспрессия D one B на 10-й эмбриональный день. При нормальной экспозиции эмульсии метка, которая выглядит черной, едва видна при данном увеличении. На этом изображении представлен идентичный срез и увеличение, как и на предыдущем снимке, но в режиме темного поля, где метки в стриатуме и таламусе отображаются белым цветом.

На данном изображении, полученном методом светлого поля, показана экспрессия в третьей щелевой системе на 12-й эмбриональный день. После избыточной экспозиции эмульсии черная метка становится отчетливо видна. SC обозначает положение спинного мозга, а CB — положение мозжечка.

Ростральная часть ориентирована влево. Представленное здесь изображение является тем же самым срезом при том же увеличении, но в режиме темного поля, где метки в спинном мозге отображаются белым цветом, что соответствует изображению в светлом поле. На следующих изображениях показано разрешение зерен серебра на клеточном уровне.

Здесь показано мечение иРНК Fox P1 в переднем мозге канареечного семечка; серебряные зерна видны в виде черных точек над клетками, окрашенными кристаллическим фиолетовым. На данном изображении видна высокая экспрессия в отдельных клетках мезоаллиума взрослой канареечной семечки. На данном изображении видна низкая экспрессия в отдельных клетках прилегающего аллиума того же среза.

Hi Fox. P один мессенджер-РНК экспрессируется в клетках мезотелия эмбриона на 12-й день развития.

Эмбриональные клетки, представленные здесь, меньше и расположены плотнее по сравнению со взрослыми клетками на двух предыдущих изображениях. Наконец, на данном изображении видна экспрессия с низкой степенью содержания в клетках прилегающего алиума того же среза. После выполнения данной процедуры можно применять и другие методы, такие как иммунохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, в каком типе клеток экспрессируется целевой ген.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить гибридизацию in situ. Не забывайте, что работа с радиоактивными реагентами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты.