Пространственно-временные манипуляции малых активность ГТФ на субклеточном уровне, и на шкале времени секунды в живых клетках

В данном видео демонстрируется метод использования УФ-излучения для управления активностью белка на плазматической мембране. Для этого клетки совместно трансфецируют мембранно-якорным белком FRB и исследуемым белком, слитым с FK BP. В среду добавляют фотолабильное производное рапамицина.

Затем в процессе визуализации живых клеток на определенный участок клетки воздействуют УФ-светом. Связующий линкер между рапамицином и биотином расщепляется, высвобождая химический димеризатор и побочный продукт; высвобожденный димеризатор диффундирует в клетки и индуцирует димеризацию между меченым FKBP целевым белком и закрепленным в плазматической мембране FRB в облученной области. Без УФ-излучения FKBP и FRB не взаимодействуют, в результате чего эффект не наблюдается.

Анализ данных показывает высоколокализованное рекрутирование исследуемого белка, слитого с FKBP, исходя из его физиологического эффекта. Преимуществом этого метода перед существующими подходами, такими как фармакологический и генетический, является сочетание скорости воздействия, специфичности мишени и пространственного разрешения. Значимость этой методики распространяется на терапию метастазирования рака, которое является следствием миграции раковых клеток.

Таким образом, манипулирование активностью ключевых факторов миграции может раскрыть точный молекулярный механизм этого процесса, что является необходимым условием для разработки методов его лечения и излечения. Демонстрацию процедуры проведут Крис Пол Мейер, аспирант, и Боб де Роуз, техник из моей лаборатории. Начните выполнение данного протокола, объединив в стерильной микроцентрифужной пробирке следующие компоненты: плазмидную ДНК, мембранно-связанный FRB, флуоресцентно-меченный FKBP, TIA one и деионизированную воду; добавьте в смесь 1 µL агарозного HD и перемешайте на вортексе.

Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение 20 минут. Во время инкубации добавьте по 50 µL полилизина в каждую лунку стеклянной восьмилуночной камеры и инкубируйте в течение одной минуты для покрытия поверхности, затем аспирируйте раствор и промойте центр каждой лунки 50 µL деионизированной воды. Затем трипсинизируйте клетки NIH 3T3 при достижении 80–85% конфлюэнтности.

После открепления клеток добавьте 10 мл DMEM с 10% FBS, перенесите 375 мкл суспензии в стерильную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 1 500 G в течение трех минут. После центрифугирования осторожно аспирируйте среду. Добавьте 750 мкл DMEM с 10% FVS и ресуспендируйте.

Ресуспендируйте осадок, осторожно несколько раз пропипетировав его вверх-вниз. Затем добавьте суспензию клеток в раствор для трансфекции и, аккуратно перемешивая наконечником дозатора, внесите по 250 µL суспензии клеток для трансфекции в каждую лунку камеры. Поместите планшет в инкубатор.

37 °C в течение 15–18 часов. Для синтеза аддукта биотина с cage rapamycin начните с приготовления 1 mM стокового раствора CRB в DMSO в стерильной центрифужной пробирке; в отдельной микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл растворите 1 мг avadon в 250 µL PBS.

Далее следует провести конъюгацию защитной группы с рапамицином. Добавьте 0,5 µL стокового раствора CRB к растворенному AVID, перемешайте путем несколькократного переворачивания пробирки, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Для получения конъюгата CRB AVID в растворе, удаления несвязанных малых молекул и очистки CRBA уравновесьте колонку для эксклюзионной хроматографии G 25, используя 300 µL PBS.

Повторите процедуру пять раз после уравновешивания колонки. Нанесите 125 µL раствора CRBA на центральный слой колонки. Затем центрифугируйте раствор в течение двух минут при 800 ×g при комнатной температуре, собирая фильтрат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл после трансфекции клеток.

Замените среду на DMEM без FBS для сывороточного голодания клеток и инкубируйте их в течение 12 часов. После инкубации осторожно аспирируйте среду и добавьте 250 µL приготовленного 1 µM раствора CRBA. Затем, для визуализации динамики белков в живых клетках, используйте конфокальный микроскоп с вращающимся диском и УФ-освещением, используя оптическую систему для подключения УФ-светодиода с длиной волны 365 нм.

С использованием эпифлуоресцентного освещения. Определите координаты и размер пятна освещения, используя стеклянную пластину, покрытую флуоресцентными красителями, возбуждаемыми УФ-светом. Это позволяет точно настроить область облучения.

Поместите камерную предметную подложку с клетками на предметный столик, используя объектив 100x и эпифлуоресцентную микроскопию. Настройте фокус и найдите отдельную клетку. Приступайте к визуализации клеток после определения фонового уровня физиологического эффекта.

Здесь степень образования мембранных оборок измеряют путем облучения УФ-светом одного выбранного квадранта клетки для высвобождения «заблокированного» рапамицина, который предварительно растворяли в DMSO, а затем в PBS до конечной концентрации 400 nanomolar. Добавьте 100 µL раствора в камеру для визуализации, чтобы вызвать общие эффекты. Выполняйте захват флуоресцентных изображений каждые 15 seconds в течение 20 minutes, чтобы определить, может ли локальная активация RAC индуцировать локальное образование оборок.

Клетки NIH 3T3 были трансфецированы YFP-меченым активатором RAC FKbp, TIA1 и закрепленным в мембране LDR. Локальному облучению FRB на краю клетки, отмеченном желтым кругом, следовало глобальное освещение ртутной лампой в течение одной секунды, начавшееся на 1063-й секунде. Как видно здесь, в начале практически не наблюдалось образования мембранных оборок.

Однако после локального освещения наблюдалось пространственно ограниченное образование оборок, в то время как после глобального освещения и добавления рапамицина, который вызывает транслокацию FKbp-TIA1 к плазматической мембране, наблюдалось общее образование оборок. Это указывает на то, что ранее наблюдавшееся локальное образование оборок было вызвано пространственно ограниченной активацией Rac. Для количественного анализа целевые клетки были разделены на четыре квадранта, и частота образования оборок в каждом квадранте при локальной, а также после глобальной стимуляции была определена, как показано на данном графике.

Ни в одной из наблюдаемых клеток не наблюдалось образования руфф при добавлении CRBA без УФ-излучения или при локальном УФ-излучении, а также при УФ-излучении с добавлением или без добавления Aden в основной среде. Однако при добавлении CRBA и проведении УФ-облучения образование руфф наблюдалось примерно с одинаковой частотой, около 90%, во всех квадрантах при глобальном облучении; когда облучался только первый квадрант, частота образования руфф составляла 100% по сравнению с 30%, 25% и 30% во втором, третьем и четвертом квадрантах соответственно. Эти результаты указывают на то, что локальное высвобождение рапамицина может быть использовано для индуцирования высоколокализованных физиологических эффектов в одной клетке.

В данном случае представлено образование мембранных оборок, вызванное активацией Rack. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как с помощью света обеспечить пространственно-временной контроль активности малых GTPases. Данный метод может быть применен к любому физиологическому процессу, который зависит от транслокации специфических белков к плазматической мембране.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости свежего приготовления растворов, реагентов и клеточных культур для каждого отдельного опыта. Не забывайте, что работа с УФ-излучением может быть крайне опасна, поэтому всегда следует использовать средства защиты, такие как УФ-очки.