Первичная система культуры нейронов по изучению простого герпеса латентности вирусов и реактивации

Целью данного эксперимента является демонстрация того, как первичная культура нейронов может быть использована для изучения латентности и реактивации вируса простого герпеса. Это достигается путем первоначального выделения нейронов верхних шейных ганглиев из эмбрионов крыс линии RA и культивирования нейронов, выделенных из диссоциированных ганглиев после удаления ненейрональных клеток. Латентная инфекция HSV устанавливается с помощью вируса EGFP для инфицирования нейронов в присутствии ингибитора литической репликации.

Следующим шагом является индукция реактивации латентно инфицированных культур. Наконец, эффективность реактивации оценивают путем мониторинга экспрессии EGFP во времени. В конечном счете можно получить результаты, демонстрирующие, как различные нейронные сигнальные пути регулируют латентность и реактивацию вируса простого герпеса с помощью химических ингибиторов, РНК-интерференции и доставки генов.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами является то, что он позволяет детально изучать на молекулярном уровне взаимодействия, регулирующие латентность вируса простого герпеса в нейронах хозяина. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области латентности вируса простого герпеса, такие как: какие сигналы подавляют латентный геном и каким образом на молекулярном уровне инициируется реактивация? В нейронах данный метод может дать представление о латентности HSV-1.

Данный метод также может быть применен к другим нейротропным альфа-герпесвирусам. Процедуру продемонстрируют Мариго Кочи и Джулиан Ким, аспиранты наших лабораторий. Нейроны верхнего шейного ганглия (SCG) для данного протокола выделяют из эмбрионов крыс на 21-й день развития (E 21), извлеченных из матки беременной самки крысы. Работая под диссекционным колпаком, усыпите каждого эмбриона, совместив ножницы с основанием шеи чуть выше плеч, и отделите голову от туловища. Чтобы обнажить ганглии, используйте иглы 23-го калибра, чтобы закрепить голову в трех точках, зафиксировав ее шеей вверх.

Сначала зафиксируйте спинной мозг булавками. Затем натяните кожу с передней части головы через нос и зафиксируйте её. В третий раз зафиксируйте пищевод и трахею, отведя их от затылочной области. Найдите верхний шейный ганглий (SCG), ориентируясь по бифуркации сонной артерии.

Сонная артерия представляет собой парную структуру. По обеим сторонам шеи расположены по одной бифуркации, таким образом, у каждого индивидуума имеется по два SCG. SCG расположен непосредственно под ветвью.

Отделите SCG от артерий, раздвигая бифуркацию за ее концы. SCG прозрачного и бесцветного вида по сравнению с непрозрачной желтоватой жировой тканью, окружающей бифуркацию. Поместите ганглии в 12 мл L 15.

Среда с добавлением глюкозы в конической пробирке объемом 15 миллилитров на льду. После сбора всех SCG из эмбрионов и их осторожного извлечения центрифугируйте ганглии в течение одной минуты при 600 об/мин, затем удалите излишки среды.

Суспендируйте ганглии в одном миллилитре среды L 15, содержащей трипсин и коллагеназу. Инкубируйте в течение 24 минут при 37 °C.

Перемешивайте каждые восемь минут. Затем добавьте 10 миллилитров морской среды для инактивации трипсина, центрифугируйте в течение одной минуты. При 600 об/мин удалите максимально возможный объем среды с трипсином и коллагеназой, после чего промойте ганглии 10 миллилитрами среды C, центрифугируя в течение одной минуты при 600 об/мин.

Повторите эту промывку один раз. Удалите промывочную среду и ресуспендируйте ганглии в одном миллилитре среды C, чтобы провести диссоциацию путем тритурации, используя иглу 21 G, прикрепленную к шприцу объемом пять миллилитров, выполнив максимум 15 циклов перемешивания вверх-вниз. Завершите тритурацию с использованием иглы 23 G до тех пор, пока большинство конгломератов не распадется.

Удалите оставшиеся скопления клеток, профильтруйте диссоциированные нейроны через нейлоновый фильтр с размером пор 70 micron в коническую пробирку объемом 50 milliliter. Отберите аликвоту фильтрованной клеточной суспензии объемом 10 microliter, смешайте с triam blue для определения количества живых клеток. Подсчитайте количество клеток, которые активно исключают краситель, с помощью гемоцитометра.

Затем в каждую лунку 96-луночного планшета для культивирования тканей, предварительно покрытого коллагеном и ламинином, внесите от 5 000 до 6 000 живых клеток в 100 µL среды C. Среда C должна содержать 50 ng/mL фактора роста нервов. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C. На следующий день, в первый день культивирования in vitro или DIV 1, проверьте правильность прикрепления нейронов и наличие роста аксональных отростков.

Замените среду C в лунках на 50 µL нейрональной базальной среды или NBM, содержащей NGF, Acho и 5-фтор-2'-дезоксиуридин. Заменяйте среду по одной строке за раз, чтобы клетки не пересохли. Инкубируйте культуры при 37 °C в течение пяти дней.

Ежедневно контролируйте культуру, чтобы подтвердить гибель ненейрональных клеток и рост нейронов. Чтобы начать эту часть процедуры на шестой день in vitro, убедитесь, что большинство ненейрональных поддерживающих клеток было элиминировано. Крайне важно максимально ограничить любые излишние физические манипуляции с нейронами на всех этапах.

Удаление и замену среды необходимо проводить очень осторожно и медленно, так как механический стресс может повлиять на жизнеспособность нейронов. Добавьте ацикловир или контрольный вариант (CV) в имеющуюся среду в каждой лунке до конечной концентрации 100 micromolar. Добавляйте CV медленно и осторожно, чтобы механическое воздействие не оказало негативного влияния на клетки на следующий день.

На 7-й день in vitro (DIV 7) инфицируйте культуры SCG рекомбинантным вирусом HSV-1, экспрессирующим репортер EGF, слитый с вирусным литическим белком US 11, с множественностью заражения (MOI) от 1 до 2. Добавьте разведенный вирус непосредственно в имеющуюся среду в лунке. Включите контрольную группу с имитацией инфекции (mock infection) и группу с литической инфекцией.

Положительный контроль в среде без CV. Позвольте инфекции протекать в течение двух-трех часов при 37 °C. Затем замените инфекционную среду на свежую NBM, содержащую NGF и CV. Крайне важно действовать очень осторожно при замене инфекционной среды. Наклоните планшет к себе и медленно удалите среду со дна лунки.

Затем направьте кончик пипетки на стенку лунки, а не на ее дно, и позвольте среде аккуратно стечь на клетки. Заменяйте среду в одном ряду за раз, чтобы клетки не пересохли. Верните культуры в инкубатор, перенося их максимально осторожно, чтобы не нарушить их способность поддерживать латентность HSV one.

Поддерживайте культуры в течение шести дней при 37 °C, чтобы вирус перешел в состояние латентности. В этот период используйте флуоресцентный микроскоп для мониторинга экспрессии us 11 EGFP в качестве индикатора литической репликации.

Как и ожидалось, в контроле с ложной инфекцией экспрессия GFP должна отсутствовать. S 11 EGFP должен определяться только при инфекции. Лунки положительного контроля без обработки CV указывают на успешную первичную инфекцию и продуктивную литическую репликацию.

Для оценки реактивации на 14-й день in vitro (DIV 14) осторожно замените среду, содержащую CV, на свежую среду без CV, как было описано ранее. Направьте кончик пипетки на стенку лунки, а не на ее дно, и при необходимости позвольте среде плавно стечь на клетки. Добавьте фармакологические или биологические переменные, такие как LY 2 9 0 0 4 в концентрации 20 micromolar.

В культурах с латентной инфекцией, обработанных A CV, экспрессия GFP не должна обнаруживаться. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение пяти-шести дней. Наблюдайте за живыми культурами с помощью флуоресцентного микроскопа для выявления нейронов, находящихся в процессе реактивации.

Частоту реактивации рассчитывают путем подсчета количества лунок, содержащих EGFP-положительные нейроны, и выражают это значение как долю от общего количества исследуемых лунок. На данном рисунке приведен пример применения триггер-статина, известного индуктора реактивации, к культурам SCG на поздней стадии инфекции. Реактивацию контролировали и оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии ежедневно в течение пяти дней после введения препарата.

При использовании TSA реактивация достигает 50% от максимума в течение двух дней, а к пятому дню — 60%. Базовая или спонтанная реактивация, представленная DMSO, в данном эксперименте для контрольных культур, подвергшихся воздействию, составляет примерно 10%, а в этой системе in vitro обычно варьируется от 5 до 20%. Впоследствии культуры инфицированных SCG также обрабатывали препаратом LY 2 9 0 0 4.

Культуры с реактивацией, индуцированной известным индуктором реактивации LY, сравнивали с культурами, обработанными ингибитором синтеза вирусной ДНК фосфоноацетоновой кислотой (PAA), а также с культурами, в которых оба соединения применялись совместно, как показано здесь. Экспрессия US 11 EGFP подавляется PAA в культурах, в которых реактивация индуцирована LY 2 9 4 0 0 2, что указывает на зависимость экспрессии US 11 EGFP от репликации вирусной ДНК. При выполнении данной процедуры важно строго соблюдать правила стерильности и максимально осторожно обращаться с культурой CG, чтобы избежать усиления спонтанной реактивации, вызванной стрессом или механическими воздействиями. После применения данной процедуры для создания латентной инфекции HSV 1 в культурах нейронов можно использовать другие методы, такие как нокдаун с помощью shRNA и эктопическая экспрессия гена дикого типа или мутантного гена, чтобы охарактеризовать нейронные функции, регулирующие латентность и реактивацию HSV 1.

Не забывайте, что HSV-1 является патогеном человека, требующим мер предосторожности уровня биобезопасности BSL-2. Перед выполнением данной процедуры вам необходимо ознакомиться с правилами работы в условиях BSL-2. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как создавать культуры SCG для установления латентных инфекций HSV-1 и как эффективно индуцировать реактивацию вируса в нейронах.