Культивирование и применение вращающихся стен биореактора полученных 3D эпителиальных клеточных моделях
3 апреля 2012 г.
Вращающейся системе культуры клеток эпителия, который позволяет клеткам расти в физиологических условиях в результате 3-D сотовой формировании совокупного описано. Агрегаты порожденных дисплей В естественных условиях-Подобных характеристик не наблюдается в обычных моделях культуры и служить более точным органотипической модельной системой для множества научных исследований.
В данном нетрадиционном протоколе представлена простая и надежная система культивирования эпителиальных клеток человека в органотипических 3D-моделях, которые воспроизводят ткани человека in vivo. Сначала эпителиальные клетки культивируют в флаконе для культур тканей до образования сплошного монослоя, после чего клетки собирают и объединяют с микроносителями в биореакторе STLV. Вращение STLV на платформе создает среду постоянного свободного падения с низким сдвигом жидкости, что позволяет клеткам прикрепляться и расти на микроносителях, формируя клеточные агрегаты через 96 часов и примерно каждый последующий день.
Обновляйте среду в SDLV для поддержания клеточного метаболизма после формирования агрегатов; еженедельно снимайте изображения образцов с помощью световой микроскопии для мониторинга хода развития после завершения формирования агрегатов и дифференцировки клеток. Перенесите агрегаты для последующего экспериментального анализа и проведения тестов. В конечном итоге данная система позволяет создавать органотипические модельные системы, приближенные к условиям in vivo, для множества научных исследований.
Основное преимущество этого метода перед существующими подходами, такими как традиционное культивирование клеток, заключается в том, что эпителиальные клетки дифференцируются и поляризуются, образуя тканеподобные агрегаты, вследствие чего их морфологическое и функциональное поведение становится схожим с поведением подлинной ткани человека. Эта система 3D-моделирования позволяет глубже изучить биологию эпителиальных клеток, взаимодействия хозяина и патогена, а также сложное взаимодействие между различными типами клеток, которые могут быть введены в систему. Д-р Андреа Радкей.
Постдок из моей лаборатории продемонстрирует процедуру детоксикации биореактора с медленно вращающимся боковым сосудом. Закройте открытые порты колпачками-заглушками. Заполните STLV 95% ethanol и выдержите в течение 24 часов для уравновешивания.
Удалите этанол, затем заполните стерилизованной дистиллированной водой и инкубируйте в течение 24 часов; используя инструменты, предоставленные поставщиком, ослабьте все винты и извлеките центральную пробку из STLV. Поместите их в стерилизационный пакет и автоклавируйте при 110 °C в течение 20 минут. Соберите STLV заново и повторите процедуру детоксикации для обеспечения стерильности.
Затем затяните винты STLV. К каждому порту прикрепите предварительно стерилизованный односторонний stopcock. Теперь извлеките поршни из шприцев Luer Lock объемом 10 мл и 5 мл и положите поршни в обертки.
Для поддержания стерильности прикрутите шприцы к стоп-крану. Добавьте DPBS в шприц объемом 10 мл до полного заполнения STLV и начала заполнения шприца объемом 5 мл. Затем вставьте стерильные поршни в каждый шприц и удалите все оставшиеся пузырьки воздуха из биореактора, поочередно перемещая поршни шприцев.
Закройте стоп-краны и закрепите STLV на вращающейся вертикальной платформе. Оставьте вращаться минимум на 24 часа, чтобы проверить наличие утечек в конической пробирке объемом 50 миллилиتر. Добавьте 15 миллилиتر DPBS к 250 миллиграммам микросфер Cytodex и автоклавируйте после охлаждения.
Трижды промойте образец культуральной средой для эпителиальных клеток, чтобы удалить DPBS. Вращайте пробирку круговыми движениями для ресуспендирования гранул. Затем ресуспендируйте гранулы в 15 миллилитрах культуральной среды.
Сначала культивируют 1 × 10⁷ эпителиальных клеток в виде монослоя в культуральных флаконах. Соберите клетки, подсчитайте их количество и определите жизнеспособность клеток с помощью окрашивания трипановым синим.
Промойте коническую пробирку, чтобы убедиться, что все клетки были перенесены. Затем извлеките DPBS и шприцы из STLV. Также удалите пробку из центрального порта с помощью серологической пипетки объемом 10 мл.
Загрузите суспензию бусин с эпителиальными клетками в STLV. Один раз промойте коническую пробирку, чтобы перенести все клетки и бусины. Затем установите заглушку центрального порта на место.
Затем извлеките поршни из шприцов объемом 5 мл и 10 мл и поместите их обратно в обертки. Для поддержания стерильности закройте входные отверстия шприцев открытыми краниками. Заполните STLV средой.
Замените плунжеры и закройте стоп-кран. Теперь выдержите свежезасеянную культуру STLV в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 минут без вращения. После извлечения STLV из инкубатора откройте стоп-кран.
Удалите все пузырьки воздуха с помощью поршней и закройте запорный кран. Затем установите STLV в режиме непрерывного вращения со скоростью 20 RPM в инкубаторе. Через 96–120 часов замените среду, извлекая шприцы и открывая оба запорных крана STLV, чтобы бусины и клетки могли осесть.
После оседания слейте около 75% среды через боковой порт с помощью шприцев для выполнения протокола кормления. Продолжайте по мере необходимости восполнять среду в зависимости от клеточного метаболизма. Также каждые пять-семь дней контролируйте рост и жизнеспособность агрегатов.
Чтобы избежать разрушения агрегатов, используйте наконечник пипетки на 1000 мкл, обрезанный примерно на два сантиметра от кончика и стерилизованный. Осторожно перенесите 200 мкл агрегатов из центрального порта и разделите на две пробирки по 1,5 мл. Одну аликвоту используйте для мониторинга жизнеспособности клеток. После отделения клеток от бусин оцените жизнеспособность методом исключения трипанового синего.
Окрашивание для визуализации клеточных агрегатов. Добавьте от 0,5 до 1 мл среды ко второй аликвоте агрегатов объемом 1,5 мл и перенесите ее в небольшую чашку Петри, используя наконечник пипетки на 1000 мкл с обрезанным кончиком; проведите визуализацию агрегатов.
При использовании инвертированного светового микроскопа для некоторых моделей эпителиальных клеток необходимо перенести агрегаты в одноразовый сосуд для улучшения аэрации культуры примерно за одну неделю до сбора агрегатов. Для анализа извлеките шприцы из STLV и слейте около 50% среды через боковой порт. Извлеките центральную пробку и осторожно перелейте все содержимое в коническую пробирку объемом 50 мл через центральный порт.
Промойте STLV дважды пятью миллилитрами среды и объедините промывочные растворы со собранными агрегатами. Затем перенесите агрегаты из конической пробирки объемом 50 миллилитров в Harv. Через одну неделю осторожно соберите агрегаты для возможных форматов анализа, тестов и анализа; дифференцированные агрегаты эпителия человека были выращены в системе биореактора STLV.
Снимки СЭМ и ПЭМ получены из клеток влагалища человека, выращенных в STLV в течение 39 дней. Обратите внимание, что 3D-агрегаты демонстрируют ультраструктурные особенности, характерные для тканей: микроскладки, инвагинации, внутриклеточные секреторные везикулы и микроворсинки на апикальной поверхности; изображения конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии 3D-клеток влагалища указывают на экспрессию муцина, а также маркеров, специфичных для эпителиальных клеток и терминальной дифференцировки. Физиологически релевантные фенотипы также служат отличной платформой для оценки токсичности соединений.
Тест МТТ, широко используемый метод измерения жизнеспособности, метаболизма или пролиферации клеток, может быть применен для оценки токсичности различных химических веществ и соединений. В качестве альтернативы токсичность после обработки исследуемыми соединениями можно измерить с помощью метода исключения трипанового синего. В данном примере после обработки ноноксинолом-9 вагинальные агрегаты продемонстрировали токсический ответ, схожий с ответом в моделях эксплантатов шейки матки, но отличный по профилю от монослоев.
3D-агрегаты функционально активны; например, они реагируют на стимуляцию молекулами микробного происхождения, которые распознаются Toll-подобными рецепторами. В ответ агрегаты секретируют провоспалительные цитокины, включая белок IL six, а также экспрессируют транскрипт рецептора прогестерона. В клетках влагалища также может наблюдаться рецептор, реагирующий на гормональную стимуляцию.
3D-агрегаты не только способны реагировать на молекулы патогенов и гормонов, но и могут функционально поддерживать инфекцию вируса простого герпеса 2-го типа. Изображение, полученное с помощью конфокальной микроскопии, демонстрирует инфицирование 3D-агрегатов влагалища вирусом HSV-2. Физические и функциональные свойства отдельных клеток внутри агрегатов также могут быть количественно определены методом проточной цитометрии; например, с помощью анализа методом проточной цитометрии для измерения экспрессии Muc1 на поверхности отдельных клеток влагалища.
В 3D-агрегатах влагалища после их формирования на поверхности экспрессировалось меньшее количество муцина по сравнению с монослоями. Этот метод позволил исследователям в области биологии тканей и инфекционных заболеваний изучать структуру и физиологические реакции на стимулы. Использование этих органотипических моделей позволяет более точно воспроизвести особенности биологии человека.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается система ротирующего культивирования клеток, которая позволяет выращивать эпителиальные клетки в физиологических условиях, что приводит к образованию трехмерных клеточных агрегатов. Эти агрегаты обладают характеристиками, схожими с условиями in vivo, что обеспечивает более точную органотипическую модель для различных научных исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Методы культивирования клеток
- Органотипические модели
- Применение в нейронауках
Теоретические основы
- Традиционные модели культивирования часто не способны имитировать условия in vivo.
- Трехмерные клеточные агрегаты позволяют лучше понять особенности поведения тканей.
- Системы вращающихся биореакторов могут улучшить рост и агрегацию клеток.
- Данный метод обеспечивает низкий уровень напряжения сдвига жидкости, что способствует прикреплению клеток.
Цель исследования
- Разработка надежной системы для культивирования эпителиальных клеток человека.
- Создание органотипических 3-D моделей, максимально приближенных к тканям человека.
- Обеспечение возможности проведения последующего экспериментального анализа и тестов.
Используемые методы
- Эпителиальные клетки культивируют до достижения состояния конфлюэнтного монослоя.
- Клетки собирают и объединяют с микроносителями в биореакторе.
- Биореактор вращают для создания условий постоянного свободного падения.
- Среду обновляют для поддержания клеточного метаболизма в процессе формирования агрегатов.
Основные результаты
- Клеточные агрегаты формируются через 96 часов и продолжают развиваться.
- Для мониторинга процесса формирования агрегатов используется световая микроскопия.
- Агрегаты демонстрируют характеристики, сходные с тканями in vivo.
- Данная система подходит для проведения различных научных исследований.
Выводы
- Система ротационного культивирования клеток эффективна для создания органотипических моделей.
- Данный подход позволяет углубить понимание поведения эпителиальных клеток.
- Это открывает новые возможности для исследований в области тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Традиционное 2D-культивирование эпителиальных клеток часто не позволяет предсказать реакции тканей человека, что создает трансляционный разрыв в процессе поиска и разработки лекарственных средств. Биореактор с вращающимся цилиндрическим сосудом позволяет формировать 3D-агрегаты эпителия с морфологией и функциями, близкими к условиям in vivo, что повышает достоверность прогнозов в доклинических моделях. Данная система способствует механистическому снижению рисков, предоставляя релевантную модели заболевания систему для валидации мишеней и разработки методов анализа.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием физиологически релевантной архитектуры и поляризации эпителия.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет воспроизведения плотных контактов, апикально-базальной ориентации и продукции слизи, характерных для условий in vivo.
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность путем моделирования реакций эпителия человека на микробные стимулы и гормональную сигнализацию.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение стандартизированных 3D-агрегатов для количественной оценки секреции цитокинов, экспрессии генов и взаимодействий с патогенами.
- Практическая ценность: позволяет проводить масштабируемый и воспроизводимый скрининг соединений с использованием МТТ-теста, метода исключения трипанового синего и проточной цитометрии.
- Научная ценность: способствует стандартизации анализов для токсикологических исследований и изучения взаимодействий «хозяин-патоген» с измеримыми функциональными показателями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Служит релевантной для патологии системой для оценки токсичности соединений и функции эпителиального барьера перед тестированием in vivo.
- Практическая ценность: Поддерживает согласование трансляционных биомаркеров с помощью количественных показателей, таких как экспрессия муцина и уровни рецепторов прогестерона.
- Научная ценность: Позволяет снизить механистические риски при отборе перспективных соединений путем моделирования истинных ответов тканей человека на стимулы.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
3D-модель эпителия, полученная в биореакторе RWV, интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарств, поддерживая валидацию мишеней посредством фенотипического скрининга и позволяя идентифицировать перспективные соединения с помощью результатов функциональных анализов.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез путем моделирования дифференцировки, поляризации эпителия и его реакций на лиганды TLR и гормоны.
- Скрининг: Позволяет получать готовые для анализа агрегаты с воспроизводимыми сроками формирования (96+ часов) и количественно определяемыми показателями жизнеспособности, секреции и инфицирования.
- Аналитика: Обеспечивает возможность получения мультиплексных данных, включая цитокиновые массивы, вестерн-блоттинг, qPCR и проточную цитометрию для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывает фундаментальные открытия с доклиническими исследованиями за счет органотипической структуры и фенотипов, реагирующих на лекарственные препараты.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для генерации моделей эпителия для различных типов клеток и терапевтических направлений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность за счет физиологически релевантной структуры, функций и способности эпителия реагировать на стимулы.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря определенным протоколам агрегации на основе микросфер и восполнения питательных сред.
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности при валидации эпителиальных мишеней.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков за счет раннего выявления соединений с благоприятным профилем взаимодействия с эпителием.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы со стерильными биореакторами, сбора клеток и обращения с агрегатами для предотвращения повреждений от сдвига.
- Зависит от доступа к биореакторам RWV (HARV или STLV), микроносителям с коллагеновым покрытием и стандартной инфраструктуре для культивирования клеток.
- Необходима межкомандная стандартизация графиков подачи среды, отбора проб агрегатов и методов оценки жизнеспособности.
- Требуется учет особенностей адаптации при переходе на неэпителиальные типы клеток или системы совместного культивирования.
- Практические ограничения включают длительные сроки культивирования (недели), а также необходимость использования специализированных методов визуализации и биохимических анализов для 3D-анализа.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:55
Preparing the STLV Bioreactor
4:01
Preparing Microcarrier Beads
4:35
Seeding Epithelial Cells and Beads into the STLV Bioreactor
6:45
Culturing, Sampling, and Photo Documentation of Cultures
8:19
Transferring and Harvesting Aggregates
9:27
3D-aggregates and Biology of Human Vaginal Epithelial Cells
11:59
Conclusion
