Использование Цистометрия в мелких грызунов: исследование мочевого пузыря Chemosensation
21 августа 2012 г.
Цистометрия является эффективным методом для оценки функции мочевого пузыря мелких животных В естественных условиях. Мочевой пузырь постоянно переплетаются со скоростью управляется через внутрипузырного катетер, в то время как мочеиспускательный канал остается свободным для мочеиспускания. Это позволяет для повторного наполнения и опорожнения мочевого пузыря, в то время как внутрипузырного давления и объема мочеиспускания записываются.
Целью данной процедуры является определение влияния химических соединений на функции накопления и опорожнения мочевого пузыря. Для этого сначала в мочевой пузырь имплантируют катетер. После короткого периода восстановления через катетер в течение 30 минут вводят контрольный раствор.
В течение следующих 30 минут, пока регистрируются данные о внутривезикальном давлении и объеме выделяемой мочи, животному вводят исследуемое соединение. В конечном итоге результаты могут показать, как раздражающие химические вещества влияют на характер мочеиспускания при анализе частоты микций. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими способами, такими как запись сократимости изолированного мочевого пузыря, является возможность изучения функции этого органа в более физиологических условиях.
Например, регуляторные функции центральной нервной системы сохраняются. Визуальная демонстрация данного метода имеет критическое значение, так как этапы операции трудно освоить из-за большого количества технических деталей и манипуляций, которые необходимо строго соблюдать для обеспечения успеха эксперимента. Чтобы подготовить трубку для имплантации в мочевой пузырь, сначала отрежьте трубку PE 50 нужной длины и наденьте небольшой белый фрагмент катетера 18G поверх основного катетера.
Затем сформируйте небольшой манжет на конце, оплавив один конец трубки, и промойте её физиологическим раствором, чтобы удалить остатки воздуха. Теперь введите изофлуран для наркоза самке крысы в возрасте от 10 до 12 недель. После введения наркоза установите поддерживающую дозу изофлурана.
Положите животное на спину и наденьте небольшую анестезиологическую маску, изготовленную из шприца объемом 10 cc. После выбривания шерсти на брюшках и дезинфекции дермы приступайте к операции. Следующая хирургическая процедура проводится одинаково как на крысах, так и на мышах.
Начните с выполнения срединной лапаротомии в нижней части живота для обнажения мочевого пузыря. Далее следует самый ответственный этап операции. Под хирургическим микроскопом наложите зизагообразный шов (шорт-шов) на купол мочевого пузыря, используя нерассасывающуюся монофиламентную нить размера 6-0.
Затем с помощью иглы выполните небольшую цистостомию внутри шва в виде «мешочка». Введите катетер PE 50 с баллоном через это отверстие. Катетеры меньшего диаметра, такие как PE 10, могут обладать более высоким и вариативным сопротивлением, поэтому они не рекомендуются.
Затяните вокруг трубки затягивающий шов (purse-string suture), используя хирургический узел. Затем осторожно вытяните катетер наружу, пока манжетный кончик не окажется непосредственно под швом. Отрезок катетера 18G придвиньте к шву, чтобы предотвратить утечку.
Проверьте наличие утечек между катетером и мочевым пузырем, осторожно вводя физиологический раствор. Устраните все обнаруженные утечки с помощью дополнительных швов.
Теперь зашейте мышцы брюшной стенки монофиламентными швами, оставив проход для катетера в верхней части разреза. Проведите катетер в межлопаточную область с помощью полого металлического стержня, чтобы предотвратить перекусывание трубки животными. После операции металлический стержень должен быть расположен под кожей, над брюшными и спинными мышцами.
Проведите стержень подкожно через всё тело животного в межлопаточную область. Завершите операцию, зашив мышцы брюшной стенки и кожу нерассасывающимся монофиламентным шовным материалом. Теперь крайне важно проверить проходимость и стабильность имплантированного катетера, промыв его физиологическим раствором.
Инфузионный раствор должен выходить из мочевого пузыря через уретру. После подкожного введения анальгетика закройте внешний конец катетера пластиковой пленкой и зафиксируйте катетер на коже в области поясницы крысы. В завершение дайте животному восстановиться в течение 30 минут.
Перед началом цитометрии убедитесь, что приборы были надлежащим образом откалиброваны. Поместите крысу в метаболическую клетку над резервуаром с маслом, который установлен на цифровых весах. Следующий шаг — подключить имплантированный катетер к трехходовому крану с помощью коннектора.
Кран следует подключить к датчику давления и инфузионному насосу. Датчик давления далее соединяется через усилитель с системой сбора данных, а компьютер, использующий общедоступное программное обеспечение, начинает контрольные измерения путем запуска инфузионного насоса для введения физиологического раствора в мочевой пузырь. В течение 30 минут метаболическая клетка подвешивается над цифровыми весами, которые используются для оценки объема выделенной крысой мочи.
Внутрипузырное давление регистрируют по мере наполнения и опорожнения мочевого пузыря. На следующем этапе препараты могут вводиться системно или интравезикально в течение еще 30 минут сбора данных. По завершении эксперимента животное следует подвергнуть эвтаназии.
Типичный график изменения давления у крысы показывает, что во время инфузии жидкости в мочевом пузыре происходит медленное повышение давления до достижения определенного порога. Затем мочевой пузырь сокращается, и мочевой сфинктер открывается, что позволяет введенному раствору выйти через уретру. Таким образом, мочевой пузырь опорожняется.
Сокращение прекратится, и давление снова упадет до базального уровня. Данные, полученные от мыши, имеют все те же характеристики. Цитометрия была использована для идентификации молекулярных мишеней горчичного масла или mo MO — это высокореактивное соединение, которое долгое время использовалось в экспериментальных моделях воспаления и гипералгезии висцеральных органов, таких как мочевой пузырь.
Как и ожидалось, интравезикальная инфузия 10 мМ MO вызвала сильное сокращение сократительного интервала у мышей дикого типа. Любопытно, что у мышей с дефицитом рецептора MO TRPA1 результат в тех же условиях был аналогичен результатам мышей дикого типа. Напротив, MO вызвала гораздо более слабые изменения системметрических параметров у мышей с нокаутом TRPV1, чем у мышей дикого типа; мыши с двойным нокаутом как TRPA1, так и TRPV1 были практически нечувствительны к дозе MO.
Данные свидетельствуют о том, что TRP V one может играть ключевую роль в висцеральном раздражении, вызванном MO. Средняя мгновенная частота мочеиспускания до и во время интравезикального введения MO подтверждает эти данные. Средняя частота рассчитана относительно введения физиологического раствора.
При выполнении данной процедуры важно убедиться, что катетер плотно прикреплен к мочевому пузырю, чтобы избежать утечки вводимого раствора в брюшную полость. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как измерять внутрипузырное давление, что включает имплантацию катетера в мочевой пузырь и помещение бодрствующих или анестезированных животных на предметный столик цитометра при контролируемом заполнении мочевого пузыря.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Цистометрия — это метод, используемый для оценки функции мочевого пузыря у мелких животных in vivo путем измерения внутрипузырного давления и объема выделяемой мочи. Данный метод позволяет изучить процессы наполнения и опорожнения мочевого пузыря в физиологических условиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Урология
- Физиология
Теоретические сведения
- Цистометрия предполагает непрерывное введение раствора в мочевой пузырь.
- Во время процедуры уретра остается свободной для мочеиспускания.
- Данный метод позволяет получить представление о функциях мочевого пузыря в сравнении с исследованиями изолированного органа.
- Он позволяет оценить влияние химических соединений на работу мочевого пузыря.
Цель исследования
- Определить влияние химических соединений на функции накопления и опорожнения мочевого пузыря.
- Проанализировать, как раздражающие химические вещества влияют на характер мочеиспускания.
- Обеспечить более физиологическое понимание функции мочевого пузыря.
Используемые методы
- Имплантация катетера в мочевой пузырь.
- Инфузия контрольного раствора в течение 30 минут.
- Регистрация внутрипузырного давления и объема выделенной мочи.
- Инфузия исследуемого соединения для анализа.
Основные результаты
- Результаты указывают на изменения частоты мочеиспускания под воздействием раздражающих химических веществ.
- Данная методика позволяет проводить повторные измерения функции мочевого пузыря.
- Полученные данные могут выявить физиологические реакции на различные соединения.
- Результаты способствуют пониманию механизмов здоровья и заболеваний мочевого пузыря.
Выводы
- Цистометрия является ценным инструментом для изучения функции мочевого пузыря in vivo.
- Данный метод расширяет понимание реакций мочевого пузыря на химические вещества.
- Он обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными исследованиями сократимости изолированного мочевого пузыря.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Цистометрия у мелких грызунов позволяет снизить риски при изучении механизмов путей химической сенсорики мочевого пузыря путем количественного определения внутрипузырного давления и объема выделенной мочи в условиях контролируемой перфузии. Данный подход способствует валидации мишеней в доклинических моделях, связывая химические стимулы с функциональными показателями мочеиспускания, что повышает прогностическую достоверность при изучении нейрогенного и гиперактивного мочевого пузыря. Этот метод обеспечивает связь между фундаментальной биологией и трансляционной медициной за счет сохранения вегетативной регуляции, которая отсутствует в анализах на изолированных тканях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез относительно роли рецепторов TRPV1 и TRPA1 в хемо- и механосенсорных путях мочевого пузыря.
- Операционная ценность: Обеспечение функциональной валидации мишеней путем анализа дозозависимых изменений частоты мочеиспускания и интервалов сокращения.
- Прогностическая ценность: Оптимизация портфеля разработок путем выявления молекулярных факторов висцерального раздражения и фенотипов гиперактивности мочевого пузыря.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для скрининга соединений путем установления исходных зависимостей между давлением и объемом.
- Количественные показатели: Получение воспроизводимых измерений объема мочи и пороговых значений внутрипузырного давления для подтверждения попаданий (хитов).
- Масштабируемость скрининга: Возможность повторного использования платформы для анализа библиотек хемосенсорных соединений посредством стандартизированного цистометрического стадирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует патофизиологию мочевого пузыря в доклинических условиях, несмотря на ограниченную прямую трансляционную ценность из-за межвидовых различий в контроле мочеиспускания.
- Снижение механистических рисков: Проясняет вклад сигнальных путей новых молекулярных участников, таких как TRPV1, в висцеральную гиперчувствительность, индуцированную горчичным маслом.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), связывая взаимодействие с мишенью с функциональными показателями мочевого пузыря in vivo.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Цистометрия интегрируется в континуум научных исследований — от проверки гипотез о мишенях и идентификации ведущих соединений до доклинической валидации, обеспечивая физиологический мониторинг функций накопления и опорожнения мочевого пузыря.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о хемосенсорных механизмах посредством контролируемой инфузии химических веществ и отслеживания зависимости давления от объема.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного и воспроизводимого количественного определения паттернов мочеиспускания при воздействии соединений.
- Аналитика: позволяет проводить сравнительный анализ частоты мочеиспускания и интервалов сокращения в качестве количественных конечных точек для оценки эффектов соединений.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преклиническую преемственность путем моделирования фармакологии мочевого пузыря в системах, релевантных заболеванию, несмотря на видовые ограничения.
- Корпоративное повторное использование: служит многократно используемым инструментом для оценки соединений, воздействующих на мочевой пузырь, в рамках нескольких терапевтических программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в хемосенсорном восприятии мочевого пузыря, связывая активность рецепторов с функциональными показателями мочеиспускания.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет калиброванного преобразования давления и измерения объема.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя функциональные данные in vivo, которые снижают риски при выборе мишеней для терапии заболеваний мочевого пузыря.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков на основе их воздействия на динамику мочеиспускания и чувствительность мочевого пузыря.
Особенности реализации
- Требуется опыт в проведении хирургических операций на грызунах, имплантации катетеров и послеоперационном уходе для обеспечения стабильности катетера и предотвращения утечек.
- Зависимость от датчиков давления, инфузионных насосов, систем сбора данных и метаболических клеток для количественного определения объема выделяемой мочи.
- Необходима межгрупповая стандартизация скоростей перфузии, дозирования соединений и определений порогов давления на всех площадках.
- Требуются корректировки при адаптации протоколов для мышей и крыс в связи с анатомическими и физиологическими различиями.
- Ограничено инвазивным характером операции и требованиями к послеоперационному восстановлению, что сдерживает пропускную способность и соблюдение норм благополучия животных.
