Фенотипическая и функциональная характеристика эндотелиальных колониеобразующих клеток, полученных из человеческой пуповинной крови

Общая цель данной процедуры — объяснить, как выделить эндотелиальные колониеобразующие клетки (eCFC) из пуповинной крови человека. Это достигается путем первоначального посева мононуклеарных клеток пуповинной крови с последующим клонированием и экспансией колониальных выростов eCFC. На втором этапе проводится характеристика клеток in vitro с использованием нового метода анализа отдельных клеток для оценки клонального пролиферативного потенциала.

Наконец, клетки характеризуют в анализе по формированию сосудов in vivo путем создания и имплантации гелей, содержащих ECFC, в мышей линии nod scid. В конечном итоге формирование новых заполненных кровью сосудов хозяина in vivo оценивают с помощью окрашивания гематоксилин-эозином (H&E) клеточных имплантатов, содержащих ECFC. Основным преимуществом данных методов по сравнению с существующими является то, что они позволяют исследовать пролиферативный потенциал эндотелиальных клеток на уровне отдельной клетки.

Значение данной методики может быть распространено на поиск диагностических и терапевтических средств для лечения таких заболеваний, как облитерирующий атеросклероз периферических артерий или ОАПА, поскольку этот метод позволяет оценить пролиферативный потенциал и генетические возможности эндотелиальных клеток пациента. Перед началом процедуры добавьте по 1 мл коллагена из хвоста крысы типа I в каждую лунку шестилуночного планшета для культивирования тканей, затем инкубируйте планшет в течение ночи; в день проведения процедуры разлейте пуповинную кровь порциями по 15 мл в конические центрифужные пробирки объемом 50 мл. Затем добавьте в каждую пробирку 20 мл PBS и несколько раз перемешайте смесь, прокачивая ее через пипетку.

Затем наберите в пипетку 15 мл Ficoll PA, поместите наконечник пипетки на дно пробирки с разведенной кровью и осторожно подлейте раствор. Центрифугируйте пробирки в течение 30 минут при 740 ×g при комнатной температуре с выключенным тормозом. После разделения клеток с помощью трансфер-пипетки удалите мутный слой мононуклеарных клеток низкой плотности, расположенный на границе раздела между слоем Ficoll и разведенной плазмой. Перенесите собранные клетки в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды EGM-2, и осадите мононуклеарные клетки путем центрифугирования в течение 10 минут при 515 ×g при комнатной температуре с установкой высокого торможения; затем осторожно аспирируйте и удалите супернатант.

Затем, после двукратной промывки осажденных клеток с помощью EGM 2, ресуспендируйте мононуклеарные клетки в EGM 2 до концентрации 1,25 × 10⁷ клеток/мл. Перенесите пипеткой по 4 мл суспензии мононуклеарных клеток в каждую лунку пластины, покрытой коллагеном, и инкубируйте клетки до образования колоний в первый день. После инкубации медленно удалите отработанную среду из лунок с помощью пипетки, чтобы не повредить слабо прикрепившиеся клетки.

Затем осторожно добавьте по четыре миллилитра E GM two в лунки и верните планшет в инкубатор. Колонии обычно появляются в период с пятого по 14-й день, за день до проведения процедуры. По 50 µL коллагена из хвоста крысы.

Как и прежде, внесите по одной единице в каждую лунку 96-луночного планшета и инкубируйте планшет в течение ночи в день проведения процедуры. Начните с двукратного промывания PBS клеток, которые прошли только два или три пассажа. После аспирации последней порции PBS поместите стерильный цилиндр для клонирования с гелевым покрытием вокруг каждой колонии, плотно прижимая каждый цилиндр к планшету с помощью стерильного пинцета.

Добавьте две-три капли теплого раствора Triple E Express в каждый клонирующий цилиндр и инкубируйте цилиндры в течение трех-пяти минут, пока клетки не начнут отделяться. После того как клетки начнут отделяться, добавьте примерно 250 µL среды EGM-2 в центр цилиндра и несколько раз перемешайте содержимое с помощью пипетки для получения суспензии одиночных клеток. Затем перенесите суспензию одиночных клеток из каждого клонирующего цилиндра по отдельности в индивидуальные микроцентрифужные пробирки.

Заинфицируйте клетки в шестилуночном планшете лентивирусами, экспрессирующими EGFP, и соберите клетки, экспрессирующие EGFP, с помощью флуоресцентной цитометрии. Затем инкубируйте EGFP-положительные клетки в среде EGM-2 в планшетах, покрытых коллагеном. Когда E-CFC будут готовы, соберите их, используя TrypLE Express, как было продемонстрировано ранее, и ресуспендируйте клетки в среде EGM-2 до конечной концентрации примерно 10⁶ клеток на мл.

Затем с помощью проточного сортера при низкой скорости потока 20 клеток в секунду распределите по одной единичной EGP-положительной ECFC в каждую лунку предварительно подготовленного 96-луночного планшета с коллагеновым покрытием; доведите конечный объем в каждой лунке с помощью EGM two примерно до 200 microliters на лунку. Затем с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа убедитесь, что в каждой лунке находится только одна клетка. Инкубируйте планшет в течение двух недель, выполняя две замены среды, до 14-го дня культивирования.

Промойте каждую лунку 100 µL PBS перед фиксацией клеток 100 µL 4% параформальдегида в течение 30 минут. Для CFC, не экспрессирующих EGFP, после фиксации параформальдегидом добавьте реагент cyt, зеленый флуоресцентный ядерный краситель, и инкубируйте при 4 °C в течение ночи. Используйте флуоресцентный микроскоп для визуального подсчета количества экспандированных эндотелиальных клеток; как показано здесь, лунки, содержащие от 2 до 50 эндотелиальных клеток, считаются кластерами эндотелиальных клеток.

Лунки, содержащие от 51 до 2000 клеток, относятся к e CFC с низким пролиферативным потенциалом, а лунки с 2001 и более клетками считаются e CFC с высоким пролиферативным потенциалом. После отсоединения клеток с помощью triple E express, как описано ранее, определите количество жизнеспособных клеток в клеточной культуре с помощью гемоцитометра и трипанового синего. Перенесите 2,4 миллиона жизнеспособных клеток в коническую пробирку объемом 50 мл, затем осадите клетки путем центрифугирования.

Тщательно перемешайте компоненты гелевой матрицы, затем доведите pH до 7.4 с помощью гидроксида натрия, удерживая раствор на льду. После удаления супернатанта ресуспендируйте осадок в 360 µL теплого e GM two. Затем добавьте к клеткам 840 µL раствора гелевой матрицы и осторожно перемешайте, пока клетки полностью не распределятся в геле. Перенесите этот 1 мл клеточной гелевой суспензии в одну лунку 12-луночного планшета для культивирования тканей и инкубируйте планшет до полимеризации геля.

Затем, перед инкубацией в течение ночи, осторожно залейте гель двумя миллилитрами теплой среды EGM two. На следующий день, непосредственно перед имплантацией, с помощью ирисовых ножниц разрежьте гель на две равные части и поместите фрагменты геля обратно в ту же лунку для культивирования, содержащую среду EGM two. После подтверждения седации с помощью щипкового теста за ушную раковину или пальцы лап, выбрейте шерсть на нижней части живота анестезированной мыши линии nude skid в возрасте от пяти до шести недель и тщательно очистите место хирургического вмешательства, используя салфетки с ротированным спиртом и бетадином.

Затем с помощью стерильных острых ирисных ножниц сделайте разрез длиной примерно пять миллиметров в нижнем квадранте живота, обнажив подкожное пространство между кожей и мышцами брюшного пресса. Тупым путем отделите дермальный слой от мышц брюшного пресса в двух разных областях живота, чтобы создать карманы шириной от 15 до 20 миллиметров: один, ведущий вверх к верхнему квадранту живота, и другой — в другую область живота. Затем приподнимите дермальный слой непосредственно у места разреза.

Вставьте один фрагмент геля в один брюшной карман, а второй фрагмент геля — в другой брюшной карман. После введения гелей зашейте каждый разрез двумя или тремя стежками, используя полипропиленовую нить 5-0 на режущей игле. Маркируйте карточки клеток, проведите послеоперационный мониторинг и обеспечьте анальгезию в соответствии с требованиями учреждения и протокола.

После умерщвления животного на 14-й день после имплантации протрите живот мыши спиртовыми салфетками и разрежьте кожу вдоль линии первоначального разреза. Затем иссеките лоскуты кожи в предполагаемых местах расположения гелей. Сделайте круговые разрезы вокруг гелей, чтобы извлечь каждый имплантат, после чего поместите извлеченные имплантаты в цинковый фиксатор.

Используя данный метод получения ECFC, мы наблюдали рост первичных колоний уже на пятый день. Обратите внимание на «булыжную» морфологию этих культур ECFC на пятый день, отмеченную стрелками. Экспансированные колонии экспрессируют эндотелиальные антигены, но не экспрессируют гемопоэтические антигены.

Как показано на этой репрезентативной оценке фенотипа эндотелиальных и гемопоэтических клеток in vitro, иммунофенотипирование выявило, что eCFC экспрессируют эндотелиальные антигены, такие как CD 31, CD 34, CD 1 44, CD 1 46, FL one, flick one, flip four и NRP two, но не экспрессируют гемопоэтические антигены CD 45, CD 14, CD 11, BC Kit, CXCR four или CD 1 33. Важно отметить, что, как показано на этой столбчатой диаграмме, экспандированные колонии демонстрируют полную иерархию клонального пролиферативного потенциала на уровне единичных клеток: от кластеров из двух-пятидесяти клеток до колоний, насчитывающих более 200. Эти микрофотографии колоний, окрашенных CytoTracker — зеленым флуоресцентным ядерным красителем, были получены после культивирования eCFC, полученных из пуповинной крови, на уровне единичных клеток в течение 14 дней.

Более того, ECFC формируют гуманизированные кровеносные сосуды, которые перфузируются эритроцитами реципиента при имплантации иммунодефицитным мышам. На данном снимке с окрашиванием гематоксилином и эозином имплантатов из геля CELLULARIZE, содержащих ECFC из пуповинной крови, видны микрососуды, заполненные эритроцитами реципиента, которые сформировались в коллаген-фибронектиновом геле через 14 дней после имплантации. Коричневое окрашивание антителами к человеческому CD 31 дополнительно подтверждает человеческое происхождение этих сосудов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять ECFC из пуповинной крови человека, а также о том, как клонировать, экспандировать и характеризовать функциональность колоний ECFC после их развития. Этот метод открыл исследователям сосудистого эндотелия путь к изучению клонального пролиферативного потенциала и генетического потенциала эндотелиальных клеток, полученных из различных источников.