Техника для TIRF микроскопии в реальном времени, одновременная съемка TCR и его ассоциированных сигнальных белков
22 марта 2012 г.
Фрагментации белков либо в мембране или в местах внутриклеточного является одним регулирующим механизмом, который может существенно влиять сигнализации результаты, поэтому, чтобы понять, сигнализация важно для изучения пространственных и временных поведение белков, участвующих. Мы описываем здесь TIRF микроскопии система для изучения передачи сигнала в Т-клетках, но широкого применения.
В данном видео описывается процедура отслеживания событий сигналинга Т-клеточных рецепторов с использованием одновременного сбора данных по двум каналам. Применяется флуоресцентная микроскопия общего внутреннего отражения или TIRF-микроскопия. Сначала Т-клетки трансфецируют плазмидой, кодирующей ZAP 70 с GFP-меткой. Затем подготавливают поддерживаемый стеклом липидный бислой, который включает липидно-якорные пептидные комплексы MHC, адгезивные молекулы и костимулирующие молекулы.
T-клетки, трансфецированные ZAP 70, добавляют к бислою, когда T-клеточные рецепторы связываются с пептид-MHC комплексами. Ассоциированные с T-клеточным рецептором цепи CD3 фосфорилируются киназой LCK семейства SARC, после чего из цитоплазмы привлекается киназа ZAP 70. Затем T-клеточный рецептор маркируют флуоресцентной меткой и проводят визуализацию, при которой клетки погружают в среду с показателем преломления ниже, чем у покровного стекла, и освещают лазерным лучом под углом, при котором происходит полное внутреннее отражение.
Это создает затухающую волну на границе раздела стекло-вода, которая затухает экспоненциально в среде, обеспечивая глубину проникновения от 100 до 200 нанометров. Таким образом, возбуждаются только флуорофоры в плазматической мембране или в непосредственной близости от нее. Анализ полученных изображений показывает, что сигнализация происходит в микрокластерах Т-клеточных рецепторов.
Основным преимуществом микроскопии TIRF или традиционной конфокальной микроскопии является получение более высокого разрешения, что позволяет легко визуализировать сигнальные кластеры или сигнальные комплексы, такие как микрокластеры TCR. Трэвис Крайтс и Чен, постдоки в моей лаборатории, продемонстрируют способ трансфекции первичных Т-клеток мыши с использованием технологии Maxi Nucleofection с последующей визуализацией методом микроскопии общего внутреннего отражения (TIRF-M) при стимуляции поддерживаемым стеклом липидным бислоем, содержащим антиген.
Этот метод широко использовался для изучения сигнальных путей в различных иммунных клетках, включая T-лимфоциты, B-лимфоциты, натуральные киллеры и тучные клетки. Метод обладает широкой применимостью и может быть использован для изучения большинства рецепторных систем в клетках млекопитающих, особенно если передача сигнала происходит в кластерах. Специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с определенными трудностями, поскольку T-лимфоциты очень трудно трансфицировать.
Кроме того, требуется точная координация, чтобы жизнеспособность Т-клеток и эффективность трансфекции, качество биляра, а также юстировка микроскопа соответствовали необходимым параметрам. Первым этапом данной процедуры является трансфекция наивных или активированных in vitro первичных Т-клеток экспрессионными плазмидами и кодирующими сигнальными молекулами с GFP-меткой с использованием набора AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit. Все Т-клетки, использованные в данном исследовании, экспрессировали A-N-D-T-C-R, который распознает пептид MCC в составе молекулы MHC IE мыши K. Процедура трансфекции, показанная здесь, проводится в соответствии с рекомендациями производителя.
Тем не менее, ниже приведены рекомендации по повышению жизнеспособности Т-клеток после трансфекции. Жизнеспособность и эффективность трансфекции выше у активированных in vitro Т-клеток, чем у наивных клеток, поэтому в данном протоколе перед началом используются активированные in vitro Т-клетки. Приготовьте два миллилитра дополненной среды для Т-клеток для каждой трансфекции, смешав в пробирке объемом два миллилитра 1,9 миллилитра среды из набора, 20 µL компонента A, 20 µL компонента B и 100 µL эмбриональной телячьей сыворотки.
Перенесите по 2 мл среды в каждую лунку 12-луночного планшета. Поместите планшет в увлажненный инкубатор при 37 °C минимум на один час для уравновешивания среды; ресуспендирование трансфецированных клеток в холодной среде или среде с pH, отличным от 7,2, приведет к гибели клеток. Для приготовления смеси для трансфекции объедините 82 мкл раствора NucleoEffector для Т-клеток мыши, 18 мкл добавки 2 и 5 мкг плазмидной ДНК, свободной от эндотоксинов, при концентрации не менее 0,5 мкг/мкл, и тщательно перемешайте путем осторожного постукивания.
Перенесите от 5 до 10 миллионов клеток в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 75 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования с помощью вакуумного аспиратора удалите максимально возможный объем супернатанта. Осторожно ресуспендируйте клеточный осадок в смеси для трансфекции, медленно аспирируя его три или четыре раза до полного исчезновения крупных клеточных агрегатов. С помощью пипетки аккуратно перенесите суспензию в сертифицированную кювету Amaxa, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха.
Выберите программу ядерного эффектора X 0 0 1 на устройстве нуклео-эффектора. Поместите кювету в держатель для кювет и нажмите кнопку для запуска выбранной программы. Затем немедленно перенесите кювету и предварительно уравновешенную культуральную среду в вытяжной шкаф.
С помощью provided пластиковой пипетки добавьте примерно 500 µL предварительно уравновешенной среды в лунку. Затем добавьте суспензию клеток в среду в планшете, добавляя её по каплям.
Инкубируйте клетки при 37 °C в течение четырех часов для обеспечения низкого уровня экспрессии белков с GFP-меткой и минимизации появления артефактов, вызванных гиперэкспрессией. В данном разделе описывается метод юстировки микроскопа для одновременной двухканальной визуализации перед включением всех компонентов микроскопа. Запустите компьютер и программное обеспечение.
Затем убедитесь, что все аппаратные компоненты распознаны программным обеспечением. Поскольку программное обеспечение запустилось без сообщений об ошибках, все компоненты были обнаружены. Разведите один µL суб-разрешения.
Перенесите флуоресцентные микросферы Flores bright в два миллилитра PBS для использования в качестве стандарта колокализации. Затем добавьте 0,25 миллилитра суспензии микросфер в каждую лунку системы восьмилуночных камерных покровных стекол Lab Tech. Установите систему камерных стекол на платформу над объективом.
Затем сфокусируйте изображение адсорбированных на стекле частиц в режиме предварительного просмотра в реальном времени. В левой части экрана отображается канал, в котором будут видны клетки, трансфицированные GFP. В правой части экрана во время экспериментов по визуализации живых клеток будет отображаться меченый TCR.
Используя регулировку по оси Y в XY, Z-системе ввода волокна, отрегулируйте положение лазерного луча так, чтобы он выходил из объектива и проецировался на потолок. Важно выполнять эту операцию, когда объектив находится в положении, при котором стеклянная плоскость находится в фокусе. Если луч на потолке рассеян, значит, луч не коллимирован.
Отрегулируйте микрометр по оси Z, чтобы добиться полной коллимации для каждой из лазерных линий, используемых в эксперименте. Затем, используя измеритель мощности лазерного излучения, настройте мощность лазера на 20–30 мкВт для каждого канала. Т-клетки крайне чувствительны к лазерному излучению, поэтому суммарная мощность освещения ограничена 50 мкВт.
Далее необходимо настроить угол для газона. Поворачивайте микрометр по оси Y на устройстве ввода волокна, чтобы сместить луч от потолка до тех пор, пока угол оптической оси относительно объективов не приблизится к 90 градусам.
Как только будет достигнут критический угол полного внутреннего отражения, лазерный луч перестанет выходить из объектива. Чтобы оценить, достигнуто ли выравнивание «дерна» (turf alignment), перемещайте фокус вверх и вниз через плоскость покровного стекла. Обратите внимание, что при выходе из фокуса адсорбированных на поверхности микросфер видно множество микросфер, плавающих в растворе. Для достижения качественного выравнивания «дерна» необходимо увеличить угол наклона луча относительно объектива.
При увеличении угла наклона луча частицы, плавающие у поверхности, начинают исчезать, а интенсивность сигнала от частиц, абсорбированных на интерфейсе, возрастает. Теперь, когда абсорбированные на интерфейсе частицы выводятся из фокуса, плавающие в растворе частицы больше не видны. В этот момент достигается правильная юстировка, так как в фокусе могут находиться только частицы, абсорбированные на покровном стекле.
Затем, чтобы совместить красный и зеленый флуоресцентные каналы друг с другом, сфокусируйтесь на микросферах и сравните положение идентифицируемых объектов на изображениях, полученных в обоих каналах. Используя микрометрические винты X и Y на одной из штатив-установок камеры, максимально сблизьте относительное положение микросфер. Обратите внимание на яркую микросферу в нижнем левом квадранте обоих изображений, чтобы обеспечить пространственное совмещение двух каналов.
Данный объект приводится в одинаковое относительное положение на обоих изображениях. Выполните захват и сохранение изображений с обоих каналов. Эти изображения будут использоваться в качестве стандарта колокализации для совмещения двух каналов.
Пример такого совмещения представлен здесь до проведения процедуры. Один из каналов повернут относительно другого, что видно на данном изображении, где наложены друг на друга снимки микросфер субразрешения из двух каналов. После внесения корректировок изображения совмещены, как показано здесь.
Качество совмещения можно дополнительно проверить, сравнив изображения живых клеток, трансфицированных GFP. Обратите внимание, что изображения Laila с двух каналов идеально совмещены после того, как было выполнено совмещение двух снимков с использованием калибровки, установленной по флуоресцентным микросферам.
После настройки микроскопа подготавливают проточные камеры, содержащие поддерживаемые стеклом липидные бислои с антигенами, и проводят запись Turf M, чтобы сначала визуализировать взаимодействие трансфицированных T-клеток с субстратом. Следуя протоколу, описанному Аной и Дастином, соберите проточную камеру с плоскими липидными бислоями, сформированными на предметном стекле с Ni-NTA липидами, молекулой адгезии ICAM-1 и пептид-MHC комплексами. Загруженные MCC IEFK встраиваются в бислой с помощью гистидиновых тегов.
Вводится костимулирующая молекула CD 80. С помощью ГПИ-якоря поместите проточную кювету на предметный столик микроскопа и закрепите её, прикрепив камеру к адаптерной пластине столика микроскопа с помощью натяжной планки для иммобилизации. Затем установите supplied производителем нагревательный элемент на проточную кювету для контроля её температуры.
Поместите объектив над бислоем и сфокусируйтесь на плоскости бислоя, чтобы обеспечить нагрев объектива и проточной кюветы; включите нагреватели проточной кюветы и объектива, чтобы довести температуру камеры до 37 °C. После четырех часов инкубации перенесите трансфицированные T-клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при ускорении 80 ×g. Ресуспендируйте клетки в 300 µL буфера H-B-S-B-S-A. Затем добавьте H 57 FAB или одноцепочечный вариабельный фрагмент H 57 для маркировки TCR до конечной концентрации 10 µg/mL для fab или 20 µg/mL для одноцепочечного вариабельного фрагмента.
Перенесите клетки в пробирку Фалькона объемом 5 мл. Затем, используя шприц с конусом объемом 1 мл, введите клетки в проточную камеру через трехходовой кран. Настройте параметры визуализации таким образом, чтобы при двухканальном режиме сбора данных в реальном времени отображался предварительный просмотр каналов TCR и GFP, и найдите поле с трансфицированными клетками.
Из-за разницы в интенсивности сигналов TCR и GFP может потребоваться корректировка масштабирования изображений в реальном времени, чтобы клетки были видны в обоих каналах. Как показано в данном случае, подтвердите освещение «газона» (turf illumination), переводя фокус вверх по плоскости стекла для обнаружения любого окрашивания латеральных мембран. Если латеральные мембраны не попадают в фокус, значит, юстировка «газона» выполнена правильно.
На этом предварительном просмотре в реальном времени окрашивание латеральной мембраны отчетливо видно как в плоскости покровного стекла, так и при смещении покровного стекла из фокуса для достижения правильного совмещения микроскопа с образцом. Угол наклона лазера относительно объектива увеличивается, и латеральная мембрана выходит из фокуса. Начните захват отдельных изображений и последовательностей таймлапса с интервалом в 10 секунд.
Клетки инкубировали в течение пяти минут на стеклянных подложках с бислоями INTA, содержащими 6 молекул на квадратный микрометр пептида с His-тегом IEFK, 100 молекул на квадратный микрометр конъюгата Alexa 647 с His-тегом ICAM-1 и 100 молекул на квадратный микрометр GPI-якорного CD80. Двухканальная одновременная регистрация методом TIRF-микроскопии проводилась при постоянном присутствии конъюгата Alexa 546 с FAB-фрагментом H57.
Для окрашивания TCR клетки подвергали визуализации в течение одного часа после первоначального контакта с бислоем. Количество кластеров ZAP 70 на клетку анализировали с помощью программного обеспечения для автоматического подсчета кластеров. В каждом случае анализировали не менее 40 клеток.
Загруженные пептиды указаны на вставке. ICAM one относится к клеткам на бислоях, содержащих 100 молекул на квадратный микрометр конъюгированного Alexa 6 4 7 His-меченого ICAM one. Как показано на рисунке, Zap 70-зависимая сигнализация происходит в микрокластерах TCR и только в ответ на агонистические лиганды, что видно в этом видео, снятом с частотой 10 секунд на кадр.
Сигнализация TCR в ответ на агонистические пептиды поддерживается непрерывным образованием микрокластеров TCR на периферии зоны контакта, которые привлекают ZAP 70. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как трансфицировать первичные Т-клетки с использованием технологии maxa nuclear affection и правильно визуализировать привлечение сигнальных молекул GFPT в микрокластеры TCR с помощью турф-микроскопии. При должном освоении эта методика может быть выполнена за семь часов при условии правильного проведения процедуры.
При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости крайне бережного обращения с первичными клетками. Чем здоровее будут клетки на каждом этапе эксперимента, тем выше будет эффективность трансфекции и тем большее количество клеток удастся зафиксировать при визуализации. Т-клетки обладают высокой подвижностью, в результате чего при последовательной съемке каналов TCR и GFP два изображения могут не совпадать идеально из-за перемещения микрокластеров TCR и самих клеток.
Для решения этой проблемы мы разработали двухканальный микроскоп для одновременной регистрации данных поверхности (turf microscope).
Обзор
В данной статье представлен метод отслеживания событий передачи сигналов T-клеточного рецептора с помощью микроскопии общего внутреннего отражения (TIRF). Этот метод позволяет визуализировать сигнальные комплексы в T-клетках, предоставляя информацию о пространственной и временной динамике белковых взаимодействий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Иммунология
Теоретические сведения
- Понимание компартментализации белков имеет решающее значение для изучения сигнальных путей.
- Микроскопия TIRF позволяет получать изображения белковых взаимодействий с высоким разрешением.
- Сигнальные события в Т-клетках необходимы для иммунного ответа.
- Предыдущим методам не хватало разрешения для эффективной визуализации микрокластеров.
Цель исследования
- Продемонстрировать систему на основе TIRF-микроскопии для изучения сигналинга Т-клеточного рецептора.
- Представить протокол трансфекции Т-клеток сигнальными молекулами, меченными GFP.
- Осветить преимущества TIRF-микроскопии по сравнению с традиционными методами.
Используемые методы
- Трансфекция первичных Т-клеток мыши ZAP-70 с GFP-меткой.
- Подготовка поддерживаемого стеклом липидного бислоя с пептид-MHC комплексами.
- Визуализация микрокластеров Т-клеточных рецепторов с помощью TIRF-микроскопии.
- Анализ сигнальных событий посредством одновременного двухканального сбора данных.
Основные результаты
- Успешная визуализация микрокластеров Т-клеточных рецепторов в процессе передачи сигнала.
- Демонстрация повышенного разрешения при использовании TIRF-микроскопии по сравнению с конфокальной микроскопией.
- Идентификация ключевых событий передачи сигнала и белковых взаимодействий в Т-клетках.
- Рекомендации по протоколу для повышения жизнеспособности Т-клеток и эффективности трансфекции.
Выводы
- Микроскопия TIRF является мощным инструментом для изучения динамики сигналинга Т-клеток.
- Данный метод широко применим к различным рецепторным системам в клетках млекопитающих.
- Дальнейшие исследования могут использовать эту методику для изучения сигналинга иммунных клеток.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод TIRF-микроскопии позволяет осуществлять одновременную визуализацию TCR и связанных с ним сигнальных белков в режиме реального времени, обеспечивая критически важное пространственное и временное разрешение для валидации мишеней на ранних этапах иммунологических исследований. Визуализируя формирование микрокластеров TCR и последующие сигнальные события, такие как привлечение Zap70, данный метод способствует механистическому снижению рисков при проверке терапевтических гипотез, касающихся путей активации T-клеток. Этот подход повышает точность прогнозирования при идентификации ведущих соединений, позволяя напрямую наблюдать белковые взаимодействия на плазматической мембране в физиологически релевантных условиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять гипотезы о сигнализации TCR путем визуализации привлечения сигнальных белков, таких как Zap70, в микрокластеры TCR в режиме реального времени.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством прямого наблюдения за активацией киназ и фосфорилированием адаптерных белков в живых T-клетках.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени, связывая взаимодействие с лигандом с формированием нижележащего сигнального комплекса с помощью количественного метода визуализации.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные количественные данные, такие как число кластеров Zap70 на клетку, с помощью автоматизированного анализа, что обеспечивает воспроизводимые условия скрининга.
- Масштабируемость: одновременный сбор данных в двух каналах позволяет параллельно контролировать связывание рецепторов и привлечение сигнальных белков, что увеличивает пропускную способность при оценке соединений или лигандов.
- Воспроизводимость: протоколы юстировки микроскопа с использованием стандартов в виде флуоресцентных микросфер обеспечивают согласованную регистрацию каналов в разных экспериментах и для разных пользователей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между этапом ранних открытий и доклинической валидацией, предоставляя релевантную модели заболевания систему для изучения динамики сигнализации TCR в определенных условиях стимуляции.
- Механистическое снижение рисков: позволяет выяснить, зависит ли наблюдаемая сигнализация от агонистических лигандов и происходит ли она специфически в микрокластерах TCR, что уменьшает неопределенность при интерпретации путей передачи сигнала.
- Согласованность с биомаркерами: способствует идентификации фосфорилизационно-зависимых событий сигнализации, которые могут коррелировать с функциональными ответами Т-клеток и результатами их дифференцировки.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от подтверждения взаимодействия с мишенью до ранней оптимизации соединений-лидеров, в частности для иммуномодуляторов, влияющих на передачу сигналов Т-клеточного рецептора.
- Фундаментальная биология: Облегчает проверку гипотез, позволяя визуализировать пространственную организацию и временную динамику сигнальных комплексов, связанных с TCR.
- Скрининг: Обеспечивает количественные данные на основе визуализации (например, формирование кластеров Zap70), что позволяет сравнивать эффективность различных лигандов или влияние генетических модификаций.
- Аналитика: Обеспечивает мультиплексный одновременный анализ локализации рецепторов и привлечения сигнальных белков, что позволяет сопоставить связывание с активацией.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность доклинических исследований путем моделирования формирования иммунологического синапса на поддерживаемых липидных бислоях с определенной презентацией антигена.
- Применимость в различных проектах: Метод адаптируем к различным рецепторным системам в клетках млекопитающих, где сигнализация происходит в кластерах, что способствует его использованию в разных исследовательских проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в передаче сигналов TCR путем прямой визуализации привлечения Zap70 в микрокластеры при взаимодействии с агонистом.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов трансфекции, подготовки липидного бислоя и процедур выравнивания двухканального изображения.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) в области иммунотерапии, предоставляя ранние механистические данные о взаимодействии с мишенью и инициации сигнала.
- Влияние на портфель разработок: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов, нацеленных на TCR, с учетом рисков, основываясь на подтвержденной способности к передаче сигналов в физиологически контекстуализированной системе.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области трансфекции первичных Т-клеток и визуализации живых клеток в контролируемых условиях окружающей среды.
- Зависит от наличия микроскопической установки, совместимой с TIRF, с возможностью одновременного двухканального сбора данных и точностью юстировки лазера.
- Необходимо стандартизировать состав липидного бислоя и презентацию антигена для обеспечения стабильного взаимодействия с TCR в разных экспериментах.
- Требуется оптимизация эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток, особенно с учетом чувствительности первичных Т-клеток к манипуляциям и артефактов, вызванных гиперэкспрессией.
- Ограничено необходимостью бережного обращения для поддержания жизнеспособности клеток и предотвращения смещения, приводящего к потере фокусировки при тайм-лапс визуализации.
