Мультимодальные изображений имплантации стволовых клеток в центральной нервной системе мышей

Общая цель данной процедуры заключается в обеспечении стандартизированного мониторинга поведения стволовых клеток, трансплантированных в мозг мыши, in vivo. Это достигается путем предварительного мечения стромальных клеток костного мозга, коэкспрессирующих EGFP и люциферазу, флуоресцентными микроразмерными частицами оксида железа. Вторым этапом является надлежащее введение меченных MPIO клеток костного мозга в ткань мозга мыши.

Затем с помощью биолюминесцентной и магнитно-резонансной томографии неинвазивно отслеживают выживаемость и локализацию клеточных трансплантатов. Заключительным этапом является подтверждение результатов визуализации in vivo с помощью посмертного гистологического анализа. Данные методы позволяют изучить поведение стволовых клеток после трансплантации в мозг мыши, а также могут быть применены к другим системам, таким как модельные организмы и исследования заболеваний.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку этапы обращения с животными сложно освоить, так как внутривенные и внутримозговые инъекции трудно выполнять, и они связаны с определенными рисками для выживаемости животных. Для начала этой процедуры добавьте 75 × 10⁶ частиц оксида железа микроразмера glacial blue в растущую субконфлюэнтную клеточную культуру. Инкубируйте их еще в течение 16 часов для обеспечения поглощения частиц путем эндоцитоза, затем удалите оставшиеся частицы путем промывки.

Дайте клеткам расти еще 24 часа для достижения конфлюэнтности и гомогенного распределения G-B-M-P-I-O. После этого с помощью флуоресцентной микроскопии визуально подтвердите поглощение частиц, рассчитав отношение EGFP-положительных и G-B-M-P-I-O-положительных клеток к общему количеству EGFP-положительных клеток. Затем дважды промойте клетки BMSC luciferase EGFP, меченные G-B-M-P-I-O, 10 миллилитрами.

Обработайте клетки трипсином с ЭДТА в PBS, после чего соберите их. Затем промойте клетки и ресуспендируйте их в PBS до конечной концентрации 133 × 10⁶ клеток на миллилитр. В завершение храните клетки на льду до момента трансплантации.

В данной процедуре анестезируйте мышь путем внутрибрюшностного введения смеси кетамина в дозе 80 mg/kg и ксилазина в дозе 16 mg/kg. Подождите пять минут до засыпания мыши, затем выбрейте шерсть на голове для проведения стерильных манипуляций. Затем поместите мышь в стереотаксическую раму и продезинфицируйте кожу спиртом.

После этого нанесите мазь на глаза животного для предотвращения дегидратации. Выполните срединный разрез кожи скальпа, чтобы обнажить череп для доступа к гиппокампу. С помощью стоматологического бора просверлите отверстие в черепе на 2 мм каудальнее и на 2 мм латеральнее.

На этом этапе подвергните суспензию клеток кратковременному перемешиванию на вортексе, затем наберите суспензию клеток в шприц. После этого опустите иглу шприца на глубину 2,5 миллиметров под твердую мозговую оболочку и подождите одну минуту для выравнивания давления. По истечении минуты извлеките иглу до положения на глубине двух миллиметров под твердую мозговую оболочку.

Затем введите 3 µL клеточной суспензии с помощью автоматического микроинъекционного насоса со скоростью 0,70 µL/мин. После инъекции подождите еще пять минут, чтобы предотвратить обратный ток введенной клеточной суспензии. Затем медленно извлеките иглу.

Затем продезинфицируйте края кожи и наложите швы. Подкожно введите 300 µL 0,9% раствора хлорида натрия для предотвращения обезвоживания. В завершение поместите мышь под нагревательную лампу для восстановления после анестезии перед проведением биолюминесцентной визуализации.

Проведите анестезию мыши смесью 3% изофлурана и кислорода. Затем поместите мышь в фотовизуализатор. Снизьте уровень анестезии, отрегулировав подачу изофлурана до 1.5%. После этого введите d-люциферин внутривенно в дозе 150 mg/kg массы тела.

Выполните сбор изображений в течение пяти минут с помощью программного обеспечения photo vision. После этого проведите обработку изображений с помощью программного обеспечения M three vision и количественно определите наблюдаемый сигнал, используя фиксированные области интереса. Для проведения магнитно-резонансной томографии анестезируйте мышь 3% ISO fluorine в смеси кислорода и оксида азота.

Затем поместите мышь в фиксатор горизонтальной МР-системы 9.4 Tesla. Снизьте уровень анестезии, отрегулировав подачу изофлурана до 1%. Далее нанесите мазь на глаза мыши для предотвращения обезвоживания. После этого используйте ректальный зонд для мониторинга температуры тела.

Затем поместите датчик под живот мыши для мониторинга частоты дыхания. Поддерживайте частоту дыхания на уровне 110 ± 10 раз в минуту и сохраняйте температуру тела постоянной в узком диапазоне 37 ± 0,5 °C. После этого поместите поверхностную РЧ-катушку на голову мыши.

Поместите мышь в центр магнита. Затем откройте ParaVision 5.1. Установите параметры последовательности в соответствии с сопровождающей статьей. После этого получите серию из 10 корональных T2-взвешенных спин-эхо изображений для получения специфической анатомической информации.

Выполните двухзвездочное взвешенное по градиенту эхо-изображение для изучения миграции стволовых клеток с плоскостным разрешением 70 µm². На этом этапе умертвите мышь и извлеките мозг. Зафиксируйте ткани мозга при комнатной температуре в 4% паральдегиде в PBS в течение двух часов.

Через два часа обезводьте ткань мозга, поместив ее в растворы сахарозы с различной концентрацией при температуре 4 °C. На следующий день заморозьте ткань мозга с помощью жидкого азота и храните ее при температуре -80 °C до момента проведения серийного срезания.

Срезы ткани мозга толщиной 10 мкм следует изготовить с помощью криостата. После этого с помощью флуоресцентного микроскопа проведите скрининг неокрашенных криосрезов на наличие синей флуоресценции от частиц G-B-M-P-I-O и зеленой флуоресценции от клеток, экспрессирующих EGFP. Затем проведите скрининг неокрашенных криосрезов на наличие зеленой и красной фоновой флуоресценции от воспалительных клеток.

Описанная процедура маркировки с использованием glacial blue MPIO обеспечивает высокоэффективное мечение БСК, клеток с люциферазой и EGFP, которое можно легко подтвердить с помощью флуоресцентной микроскопии. Далее, после трансплантации G-B-M-P-I-O, меченных БСК и клеток с люциферазой и EGFP в ЦНС мышей, выживаемость клеточного трансплантата можно отслеживать с помощью биолюминесцентной визуализации in vivo на основе активности люциферазы. Кроме того, точную локализацию трансплантированных клеток можно контролировать с помощью магнитно-резонансной томографии in vivo на основе содержания железа в glacial blue MPIO.

Наконец, гистологический анализ подтверждает результаты, полученные с помощью биолюминесцентной и магнитно-резонансной томографии. Стабильная выживаемость была подтверждена устойчивой экспрессией EGFP с течением времени после её развития. Данный метод открыл исследователям в области молекулярной визуализации путь к изучению клеточных и молекулярных событий после трансплантации стволовых клеток на различных моделях нейродегенеративных заболеваний у животных.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить молекулярную визуализацию с применением биолюминесценции и магнитно-резонансной томографии, а также надлежащим образом подтверждать результаты in vivo с помощью посмертной гистологической оценки.