Мониторинг изменений в внутриклеточной концентрации кальция и синаптической эффективности в Моллюск

Внутриклеточный кальций считается важным компонентом нескольких механизмов синаптической пластичности. Эти предположения можно проверить путем одновременного мониторинга изменений уровня кальция и вариаций синаптической эффективности. В данной работе мы демонстрируем, как это реализуется при сочетании кальциевого имиджинга с внутриклеточной регистрацией.

Наши эксперименты проводятся на ганглии моллюска Aplysia Cahora. Данный препарат обладает рядом преимуществ, таких как крупные идентифицированные нейроны, низкие температуры, естественные для apia, и медленные сигналы, облегчающие визуализацию, однако демонстрируемые нами общие методы легко переносятся на другие системы. Здравствуйте, я Колин Эванс из лаборатории Элизабет Кроппер на кафедре нейробиологии Fishburg и в Институте мозга Фридмана при Медицинской школе Маунт-Синай в Нью-Йорке.

Сегодня мы продемонстрируем одновременную визуализацию изменений внутриклеточной концентрации кальция и синаптической эффективности в буккальном ганглии моллюска Aplysia cahora. Для детекции внутриклеточного кальция мы введем в пресинаптический нейрон проникающий через мембрану индикатор кальция calcium orange. Затем препарат переместят под микроскоп, после чего в пре- и постсинаптические нейроны будут введены острые электроды.

Повторная пресинаптическая стимуляция приводит к усилению постсинаптического ответа, что проявляется в увеличении амплитуды постсинаптического потенциала или ПСП. Измерение флуоресцентного сигнала индикаторного красителя кальция позволит нам зафиксировать одновременные изменения внутриклеточного кальция в пресинапсе. Для начала проведите анестезию взрослого животного весом около 150 граммов путем инъекции 75 мл изотонического раствора хлорида магния, закрепите анестезированное животное на чашке, покрытой воском, затем с помощью анатомического пинцета и ножниц сделайте надрез на стопе животного и обнажите буккальную массу.

Буккальный ганглий расположен на вентральной стороне буккальной массы и состоит из двух соединенных полуганглиев. Он содержит несколько сотен нейронов, которые совместно с нейронами других ганглиев участвуют в формировании и контроле пищевого поведения животного. Осторожно освободите ганглий, перерезав все буккальные нервы мелкими ножницами, и извлеките его из организма животного.

Затем закрепите освобожденный ганглий булавками к основанию чашки с силиконовым покрытием, заполненной искусственной морской водой. Ганглий окружен оболочкой из соединительной ткани, которую необходимо удалить, чтобы обнажить отдельные нейроны. Используя verifying forceps, ирисные ножницы и соблюдая крайнюю осторожность, аккуратно вырежьте эту оболочку.

Чтобы избежать повреждения нейронов, зафиксируйте деsheath-ганглий с помощью булавок примерно на 15 минут, так как любые смещения будут препятствовать проведению визуализации. Для подготовки острых электродов для внутриклеточной регистрации и инъекции красителя вытяните капиллярные трубки с помощью микроэлектродного пуллера. Мы используем тонкостенное боросиликатное стекло с внешним диаметром 1 мм.

Регистрирующие электроды при заполнении 3 M ацетатом калия должны иметь сопротивление около 10 МОм, поэтому мы настраиваем пуллер соответствующим образом для изготовления D-электродов. Опустите задний конец вытянутого электрода в 10 мМ раствор красителя Calcium Orange; за счет капиллярного эффекта вдоль стеклянной нити внутри электрода краситель втянется в кончик, затем заполните электрод 200 мМ хлоридом калия для обеспечения хорошего электрического контакта. Мы используем специально сконструированный блейстер для улучшения свойств электрода и снижения его сопротивления примерно до 5 МОм.

Электрод удерживают под углом 45 градусов в потоке суспензии оксида алюминия. Добавление хлорида натрия в суспензию и подключение омметра позволяет контролировать сопротивление электрода. В процессе формирования скоса мы переносим чашку с препарированными ганглиями в установку для электрофизиологии и находим интересующие нас нейроны, прокалывая их электродами и подтверждая их идентичность.

Для подготовки нейрона к кальциевому имиджингу мы сначала вводим электрод, заполненный красителем, в сому клетки и вводим краситель электрофоретически с помощью гиперполяризующих импульсов тока 15 nA в течение 30 минут. По мере проникновения красителя Calcium Orange в клетку сома приобретет слабый розовый цвет. Затем мы осторожно извлекаем регистрирующие электроды и оставляем препарат минимум на 30 минут, чтобы краситель диффундировал в тонкие отростки нейрона.

Затем перенесите чашку с препаратом на флуоресцентный микроскоп. Мы используем объектив с увеличением 10x и NA 0,3 для иммерсии в воду на вертикальном микроскопе с фиксированным предметным столиком, в котором фокусировка осуществляется путем перемещения объектива, а не столика. Это облегчает установку манипуляторов.

Для регистрирующих электродов выберите подходящий блок фильтров. Блок из трех фильтров SI обеспечит правильные фильтры возбуждения и эмиссии для calcium orange; настройте параметры камеры и интенсивность освещения с помощью нейтральных светофильтров и диафрагмы поля зрения. Увеличение количества света приведет к снижению уровня шума, но может вызвать обесцвечивание препарата.

ПЗС-камера CoolSnap может захватывать поле размером 500 на 300 пикселей с частотой около 30 кадров в секунду и хорошим соотношением сигнал/шум. Минимизируйте освещение нейронов fil, по возможности держа затвор источников света закрытым. В программном обеспечении для визуализации выберите области интереса (ROI).

Эти области определяют места, в которых программное обеспечение будет проводить измерения интенсивности. Как правило, мы визуализируем первичные, вторичные и третичные ветви пресинаптического нейрона. Разместите дополнительную область интереса (ROI) рядом с нейроном difi, чтобы получить значение фона, которое в дальнейшем будет вычтено из всех остальных точек данных.

Для индукции и мониторинга синаптической передачи используются внутриклеточные регистрирующие электроды в пре- и постсинаптических нейронах. Синхронизацию между сбором электрофизиологических данных и данными визуализации можно обеспечить, используя сигнал триггера выхода кадра (frame out) камеры для запуска программного обеспечения сбора данных. Другим способом обеспечения синхронизации является установка светодиода внутри порта камеры.

Этот светодиод кратковременно включается в начале сеанса записи, создавая таким образом синхронизационную метку. В ходе типичного эксперимента вы вызываете потенциалы действия в пресинаптическом нейроне путем инъекции коротких импульсов тока. В данном примере мы демонстрируем серию спайков и соответствующее усиление кальциевого сигнала для проверки конкретных гипотез.

Кальциевый сигнал можно модулировать, чтобы определить его влияние на синаптическую передачу. Например, такие препараты, как хелатор кальция EGTA, можно вводить пресинаптически или подавать через систему перфузии. Данные анализируют путем их экспорта из программного обеспечения для визуализации в текстовый файл, а затем в программу, которая использовалась для сбора электрофизиологических данных; в нашем случае это Spike2 от компании Cambridge Electronic Design.

Мы используем специально написанный скрипт для построения графиков значений интенсивности в ROI и соответствующих изменений мембранного потенциала, чтобы количественно оценить изменения кальциевого сигнала путем вычитания фонового сигнала, полученного из фонового ROI, и расчета относительного изменения по представленной формуле. F zero — это флуоресценция непосредственно перед стимуляцией, а F — флуоресценция во время стимуляции. Здесь мы демонстрируем результаты эксперимента, в котором регистрировались изменения кальциевой флуоресценции в идентифицированном нейроне B 21.

Область, которую мы визуализировали, показана на A; на B1 мы вызвали пачку спайков в B21, что привело к возникновению постсинаптических потенциалов в B8 и изменению кальциевого сигнала. На B2 показан эффект инъекции хелатора кальция EGTA: спайки в B21 больше не вызывают широкомасштабного увеличения флуоресценции кальция, а амплитуда постсинаптического потенциала снижается.

В заключение мы продемонстрировали методы, которые могут быть использованы для одновременного мониторинга внутриклеточной концентрации кальция и оценки эффективности синаптической передачи. Эти методы требуют лишь скромного оснащения по сравнению с большинством методов функционального имиджинга, а также просты и быстры в освоении.