Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

Общая цель данной процедуры заключается в получении изображений поведения клеток внутри эмбриональной нервной трубки с высоким разрешением в течение длительных периодов времени. Это достигается путем предварительного пересечения ранней нервной трубки с использованием конструкции, обеспечивающей экспрессию выбранного флуоресцентного белка для маркировки отдельных клеток. Следующим этапом является изготовление срезов раннего эмбриона и их закрепление на планшетах с стеклянным дном.

После восстановления в инкубаторе срезы эмбрионов визуализируют на широкопольном микроскопе с определенными интервалами. В конечном итоге этот метод может быть использован для изучения поведения клеток в развивающемся нейроэпителии в течение длительного времени с высоким пространственным и временным разрешением. Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими способами визуализации живых тканей является возможность наблюдения за поведением отдельных клеток на протяжении длительных периодов времени с высоким пространственным и временным разрешением.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии развития, такие как роль ориентации веретена деления в выборе судьбы клетки или то, каким образом динамика сигналинга может регулировать поведение клеток перед электропорацией плазмид в нервную трубку. Стеклянные иглы изготавливают с помощью микрокапиллярного пуллера под диссекционным микроскопом. С помощью тонкого пинцета отломите кончик иглы.

Кончик иглы должен быть достаточно острым, чтобы проколоть нервную трубку, но не настолько узким, чтобы препятствовать введению раствора ДНК. Эмбрионы для данного эксперимента инкубировали при 37 °C в течение примерно 36 часов до достижения 10-й стадии по Гамильтону.

Для начала данной процедуры выполните создание окна в яйце и установите электроды на расстоянии пяти миллиметров друг от друга по обе стороны от эмбриона, затем введите ДНК в нейральную трубку. Для визуализации ДНК окрашивают небольшим количеством быстрого зеленого (fast green). Подайте ток напряжением от 12 до 17 вольт с длительностью импульса 50 миллисекунд трижды, с интервалом 950 миллисекунд между импульсами.

Для достижения мозаичной экспрессии, позволяющей отслеживать отдельные клетки, используют низкие концентрации ДНК и низкие напряжения электропорации. В завершение заклейте окно в яичной скорлупе клеточной лентой, убедившись в герметичности уплотнения. Оставьте эмбрионы для восстановления на три-четыре часа или на ночь при 37 °C.

Коллагеновую смесь и среду для культивирования срезов следует подготовить примерно за час до начала нарезки эмбрионов. Для приготовления коллагеновой смеси смешайте 100 µL 0.1% раствора уксусной кислоты с 300 µL коллагена I типа и тщательно перемешайте на вортексе, затем добавьте 100 µL 5-кратной среды L 15 и снова тщательно перемешайте на вортексе. В результате раствор должен стать желтым.

Затем добавьте от 15 до 20 µL 7,5% бикарбоната натрия и тщательно перемешайте на вортексе. Раствор должен приобрести слабо-розовый цвет. Храните на льду.

Данную смесь коллагена следует готовить непосредственно перед использованием. Для приготовления среды для культивирования срезов добавьте в 10 миллилитров нейробазальной среды (neurobasal medium) добавку B 27, Glutamax и раствор гентамицина, после чего поместите среду в инкубатор при температуре 37 °C с буферизацией 5% углекислым газом. Оставьте крышку контейнера неплотно закрытой, чтобы среда достигла равновесия с углекислым газом в течение как минимум одного часа.

Для начала данной процедуры с помощью маленьких ножниц вырежьте эмбрион. Извлеките эмбрион из яйца пинцетом, промывая его средой L 15. Поместите эмбрион в чашку для культивирования тканей с инертным слоем Sylgard на дне.

Закрепите эмбрион булавками через окружающие внезародышевые оболочки таким образом, чтобы оболочки были плотно натянуты. С помощью микроножа сделайте разрез эмбриона максимально прямо через интересующую область. Срезы спинного мозга должны быть толщиной от одного до двух сомитов; прикрепляйте срезы к латеральным тканям эмбриона, чтобы они не потерялись во время нарезания других эмбрионов.

Для переноса срезов спинного мозга в чашку с стеклянным дном потребуется модифицированный наконечник микродозатора. Для этого закрепите наконечник объемом 200 мкл на дозаторе P2 или P10 и отсеките примерно 1 мм от его конца. Покройте внутреннюю поверхность наконечника коллагеном, используя 1 мкл ранее приготовленной коллагеновой смеси.

Оставьте на одну-две минуты, затем промойте средой L 15. Это предотвратит прилипание ткани к внутренней поверхности наконечника. Теперь с помощью микроножа отделите срез от эмбриона и извлеките его из чашки, используя дозатор P 2 или P 10 с наконечником на 200 µL.

Старайтесь захватить как можно меньше среды. Перемешайте смесь коллагена на вортексе и нанесите от 5 до 8 µL на стеклянную чашку с покрытием из полилизина и покровным стеклом в качестве основания; немедленно поместите срез эмбриона в коллаген и расположите его с помощью тонкого пинцета. LICs должны быть расположены так, чтобы сторона, подлежащая визуализации, плотно прилегала к покровному стеклу.

Ткань должна прикрепиться к покрытию из полилизина на покровном стекле. Повторяйте эту процедуру, пока на покровном стекле не окажется несколько срезов. Обычно на одно стекло помещают от шести до девяти срезов.

Когда все срезы будут расположены на своих местах, добавьте от двух до трех микролитров среды L 15 к первому помещенному коллагену и накройте чашку. Дайте коллагену застыть в течение 20 минут. После застывания коллагена осторожно добавьте два миллилитра среды для культивирования срезов, которая выдерживалась не менее одного часа при 5% carbon dioxide и 37 °C.

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы коллаген не отделился от покровного стекла; поместите образец в инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide, оставив срезы для восстановления минимум на три часа перед началом визуализации. Визуализация поведения клеток внутри ткани в течение длительного времени с высоким временным и пространственным разрешением является сложной задачей. Для получения качественных результатов крайне важно сочетание оптимальных условий культивирования и использование микроскопии светлого поля.

Для получения изображений срезов используется широкопольный микроскоп delta vision core, оснащенный экологической камерой weather station. В камере постоянно поддерживается температура 37 °C, а с помощью аппарата перфузии углекислым газом на предметном столике микроскопа поддерживается состав газовой среды: 5% carbon dioxide и 95% Air. Съемка обычно проводится с использованием масляного иммерсионного объектива 40x с числовой апертурой NA 1.30, захват изображений осуществляется с помощью CCD-камеры core snap HQ two. Z-стеки снимаются с шагом 1.5 µm на протяжении 45 µm толщины ткани. Время экспозиции следует поддерживать на минимальном уровне, например, от 5 до 50 ms.

Для каждого указанного среза изображения фиксируются каждые семь минут. С помощью систем Delta vision можно посетить до девяти срезов. Функция точного перемещения между точками, показанная здесь, представляет собой пример последовательности таймлапс-съемки клетки-предшественника спинного мозга, трансфицированной конструктом, экспрессирующим GFP alpha Tubulin; визуализация была начата на срезе спинного мозга двухдневного эмбриона стадии HH 12.

На этом раннем этапе нейральные клетки-предшественники подвергаются преимущественно симметричным делениям по типу «предшественник-предшественник», в ходе которых клетка делится с образованием двух новых циклирующих клеток-предшественников. На данном рисунке представлены отдельные кадры из только что показанной последовательности таймлапс-съемки. Через две часа 20 минут клетка делится по плоскости расщепления, перпендикулярной апикальной поверхности, в результате чего образуются две дочерние клетки.

Эти две клетки снова делятся через 24 часа 23 минуты и через 25 часов 54 минуты. Следующая последовательность таймлапс-съемки представляет клетку, трансфицированную G-F-P-G-P-I для маркировки клеточной мембраны. Эта клетка подвергается делению, в ходе которого базальный отросток разделяется надвое, что показано белыми стрелками, и поровну распределяется между дочерними клетками.

Выбранные кадры из этой последовательности таймлапса показывают, что деление клетки происходит на 0 часах и 49 минутах. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как подготавливать срезы спинного мозга и проводить их визуализацию. Помните, что если вы только начинаете осваивать этот метод, поначалу могут возникнуть сложности, так как процедура включает ряд технически трудоемких этапов, которые должны быть выполнены согласованно для достижения результата.