Развитию облитерирующего бронхиолит в мышиной модели ортотопической трансплантации легких

Общая цель данной процедуры — создание модели итеративного бронхиолита, имитирующей ортотопическую трансплантацию легких. Это достигается путем первоначального извлечения донорского легкого у мыши линии C 57 BL 10. На втором этапе подготавливается манжета бронха, легочной артерии и вены для проведения анастомоза.

Затем подготовленное донорское легкое пересаживают мыши линии C57BL/6. Заключительным этапом является наблюдение за пересаженной мышью в течение 21 или 28 дней после операции. В конечном итоге для выявления очагов литеративного бронхиолита в трансплантате легкого проводится гистологический анализ.

Основным преимуществом данной модели по сравнению с зеркальной моделью гетеротопической трансплантации дыхательных путей является то, что текущая модель имитирует состояние человека. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как верхние структуры дыхательных путей у мышей очень хрупкие и более подвержены повреждениям, поскольку их масса составляет всего одну десятую от массы крысы. Поместите мышь-донор в герметичную удерживающую камеру и проведите анестезию 5% изофлураном. Затем с помощью внутривенного катетера 20G проведите интубацию трахеи мыши и подключите ее к вентилятору для грызунов.

Поддерживайте анестезию, используя изофлуран в концентрации от 1 до 2%. Убедившись, что мышь полностью находится под наркозом (отсутствие реакции на щипок за хвост и за палец лапы), поместите ее в положение на спине и обработайте живот 70% спиртом. Затем с помощью ножниц вырежьте кожу над брюшной полостью, чтобы обнажить мышцы брюшного пресса.

Затем выполните лапаростернотомию: сначала сделайте разрез по срединной линии через брюшную стенку, затем произведите поперечный разрез грудины, отодвиньте кишечник и найдите нижнюю полую вену, расположенную непосредственно под печенью. Введите гепарин в нижнюю полую вену из расчета 100 µl на кг массы тела. Далее оттяните серповидную связку печени и рассеките диафрагму вдоль вентрального каудального прикрепления в сторону позвоночника.

Произведите разрезы обеих сторон грудной стенки до шеи, чтобы обнажить грудную полость. Перережьте ребра с обеих сторон, оберегая легкие, и удалите тимус. Затем перережьте внутригрудную нижнюю полую вену на уровне диафрагмы.

Теперь найдите сердце и иссеките правое ушко предсердия. Затем сделайте поперечный разрез у основания ствола легочной артерии и через этот разрез промойте легкие двумя миллилитрами охлажденного раствора Рингера-лактата и 0,1 миллилитра гепарина. Обнажите трахею, после чего отсеките ее вместе с пищеводом.

Теперь прекратите вентиляцию на двух третях конца фазы вдоха. Вырежьте сердце вместе с длинным блоком тканей и поместите его на лед. Накройте вырезанное легкое марлей, чтобы защитить его от света.

Разрежьте легочную связку до легочной вены или pv. Удалите пищевод и аорту, чтобы локализовать корень легкого. Найдите легочную артерию или pa, которая расположена в самой краниальной части корня легкого, и прилегающий к ней главный бронх.

Осторожно отделите легочную артерию от бронха. Теперь изготовьте манжету легочной артерии из внутривенного катетера 24G, обрезав его до длины 0,5 мм с выступом 0,7 мм. Поверхность манжеты представляет собой плетеную структуру AB.

Чтобы создать поверхность для анастомоза, изготовьте манжету для бронха из материала, аналогичного материалу манжеты легочной артерии, используя катетер 20-го калибра, разрезанный до длины 1 мм с выступом 0,7 мм. Размер манжеты легочной вены варьируется в зависимости от веса мыши-донора. Для мышей весом от 24 до 27 г.

Размер манжеты составляет 22G с длиной 0,7 мм и вылетом 0,7 мм для мышей весом от 27 до 32 г. Длина такая же, но используется катетер 20G. Теперь введите манжеты в дистальные отделы легочной артерии, легочной вены и бронха, фиксируя каждую нитью из шелка 9-0.

После того как все манжеты будут правильно закреплены, оберните подготовленное донорское легкое марлей, смоченной в растворе Рингера лактате, и поместите на лед до начала трансплантации. Для подготовки мыши-реципиента введите наркоз и подключите к аппарату искусственной вентиляции легких тем же способом, который использовался для донора.

Обривают левую сторону грудной клетки и обрабатывают 70% спиртом. Начинают с выполнения разреза для торакотомии в левом третьем межреберье. Разрез продлевают в дорсальном направлении почти до позвоночника.

Убедитесь, что операционное поле застелено стерильными салфетками, и наложите микрососудистый зажим на левые легочные сосуды и бронх рядом с сердцем. Легочная артерия видна со стороны краниального отдела, легочная вена — в каудальной части ворот легкого, а бронх расположен между ними. Затем, используя гемостат, осторожно потяните, чтобы создать легкое натяжение легочной артерии, легочной вены и бронха.

Оставьте структуры ворот легкого зажимленными и осторожно проведите резекцию левого легкого. Изолируйте легочную артерию, легочную вену и бронх, затем наложите вокруг каждой структуры свободный шов. Полностью отделите PA от адвентициальной оболочки, после чего сделайте небольшой поперечный разрез передней стенки сосуда длиной примерно одну четверть от его окружности.

Оставив нетронутым продолжение дорсальной части артерии, извлеките донорское легкое, обернутое в хлопковую марлю, смоченную холодным раствором Рингера с лактатом, и поместите его в грудную полость. Затем вставьте манжеты в легочную артерию (pa), легочную вену (PV) и бронх реципиента для создания анастомоза и лигируйте их наношвом. После этого удалите легкое реципиента.

Затем снимите зажим с ворот легкого для восстановления реперфузии и вентиляции. Поместите трансплантированное легкое обратно в грудную клетку реципиента и зашейте разрез торакотомии нитью 5-0. Теперь мышь должна выйти из состояния наркоза. Для облегчения боли после восстановления сознания мыши можно ввести бупренорфин.

В этой таблице представлены гистологические баллы острого отторжения и распространенность облитерирующего бронхиолита или ОБ. Послетрансплантационная оценка острого отторжения обозначается как балл A. В группах с аллотрансплантатами наблюдается значительно более выраженная патология острого или хронического отторжения по сравнению с изо трансплантатом. Кроме того, на 21-й и 28-й дни после трансплантации распространенность облитерирующего бронхиолита была значительно выше в группах с аллотрансплантатами, чем в группе с изо трансплантатом.

Здесь представлены макроскопические данные и результаты гистопатологии через 28 дней после трансплантации легких. На этих изображениях показаны макроскопические признаки, а также легкое из изографта и правое наивное легкое, окрашенные гематоксилином и эозином. На данных изображениях представлены аллотрансплантаты легких от мышей BL 10, пересаженные реципиенту мыши BL 6, с окрашиванием гематоксилином и эозином, а также трихромным окрашиванием по Массону, у которых развился OB и non OB соответственно.

Белая стрелка на панели B указывает на поражения OB. На данной панели показан аллотрансплантат легкого мыши BL 6, пересаженный реципиенту мыши BL 10. После того как техника будет освоена, ее выполнение при правильном подходе может занять почти полчаса.

Полезность данного метода заключается в том, что его можно использовать для поиска ответов на вопросы о механизмах развития первичной дисфункции трансплантата, острого отторжения и аблативного бронхиолита после трансплантации легких.