Солюбилизации и Био-сопряжения квантовых точек и бактериальные анализы токсичности по кривой роста и плиты графа

Общая цель данной процедуры заключается в проведении высокопроизводительного скрининга антибактериального действия наночастиц с конъюгацией с антибиотиками или без нее. Для достижения этой цели тестируется антибактериальный эффект квантовых точек теллурида кадмия, конъюгированных с полимиксином B. Сначала квантовые точки растворяют в меркаптопропионовой кислоте.

Затем квантовые точки конъюгируют с полимиксином B, после чего бактерии, высеянные на чашки с антибиотиком, обрабатывают как конъюгированными, так и неконъюгированными с антибиотиком квантовыми точками; при этом половину образцов подвергают облучению синим светом с длиной волны 440 нанометров в течение 30 минут, что вызывает генерацию экситонов и активных форм кислорода квантовыми точками для оценки влияния обработки квантовыми точками на рост и выживаемость бактерий. Проводят измерения оптической плотности и подсчет колоний. Полученные данные указывают на то, что применение квантовых точек теллурида кадмия, конъюгированных с антибиотиком, с последующим облучением приводит к наиболее выраженному бактерицидному эффекту среди всех протестированных условий.

Хотя данный метод позволяет изучить влияние квантовых точек теллурида кадмия и их конъюгации с полилизин B на рост E coli, он также может быть применен к другим типам наночастиц и антибиотикам при воздействии на различные штаммы бактерий. Как правило, лица, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как любой избыток MPA приведет к агрегации квантовых точек, а если при пипетировании будет допущено даже небольшое отклонение в объеме, это приведет к повреждению фильтра.

Хотя сегодня мы продемонстрируем метод оценки антибактериального действия квантовых точек KE IDE, конъюгированных с антибиотиком, аналогичный метод может быть использован и с другими типами квантовых точек, такими как фосфат индия, сульфат цинка и иодид кадмия-сульфат цинка. Начните процедуру с приготовления в стеклянном флаконе 15 мкМ раствора квантовых точек теллурида кадмия или CDTE в толуоле; измерьте оптическую плотность (OD) методом абсорбционной спектроскопии, затем с помощью пипетки перенесите 200 мкл этого стокового раствора в стеклянный флакон.

Не используйте пластик. Затем добавьте 800 µL толуола, 1 mL 200 mM боратного буфера и 2 µL 11,5 M 3-меркаптопропионовой кислоты (MPA), закройте флакон крышкой и интенсивно встряхивайте в течение 30–60 секунд. После встряхивания водная и органическая фазы разделятся самопроизвольно.

Водная фаза окрасится в цвет квантовых точек. Чтобы избежать попадания слоя тилинга, удалите его, затем извлеките фазу с квантовыми точками и перенесите ее в чистую пробирку. Для очистки сольватированных квантовых точек перенесите их в центрифужный фильтр объемом 500 µL.

Добавьте 100 µL 50 мМ буфера bore eight и центрифугируйте при 3000 ×g в течение 13 минут. Повторите эту процедуру промывки четыре раза. После финальной промывки суспендируйте промытые квантовые точки в 500 µL буфера bore и храните при 4 °C.

Они будут стабильны в течение одной-двух недель. Для оценки концентрации квантовых точек измерьте спектры поглощения и испускания. На этом рисунке показаны квантовые точки CDTE при освещении УФ-лампой, а также спектры испускания до и после растворения в воде, демонстрирующие незначительное изменение оптических свойств в результате обмена лигандов.

Эта часть протокола применима к любым отрицательно заряженным наночастицам, включая мох, коммерческие квантовые точки, металлические частицы и другие. В данном примере антибиотик полимиксена B или PMB будет конъюгирован с квантовыми точками в молярном соотношении 30 к 1. PMB имеет положительный заряд и самоорганизуется без необходимости конъюгации. Реагенты: растворите PMB в воде.

При концентрации 60 мкМ. Для 96-луночного планшета с 0,3 мл бактерий на лунку в четырехкратных повторах достаточно 0,5 мл конъюгата с концентрацией 200 нМ, который готовят путем добавления 100 мкл квантовых точек с концентрацией 1 мкМ в 50 мМ боратный буфер в микроцентрифужную пробирку.

Затем добавьте 50 µL раствора антибиотика PMB в воде с концентрацией 10 x или 60 µM в пробирку с конъюгатом. В контрольную пробирку добавьте 50 µL воды. Доведите объем до 0,5 mL с помощью 50 mM ацетатного буфера. Защитите пробирки от света алюминиевой фольгой и поместите их на ротатор на один час.

При возникновении агрегации повторите конъюгацию, используя более низкие концентрации антибиотика. Постепенно увеличивайте концентрацию до тех пор, пока частицы не перестанут агрегировать при промывке конъюгатов. Пропустите растворы через фильтр с порогом отсечения по молекулярной массе 10 000 Да, который подходит для большинства антибиотиков, но не для белков или антител.

Наконец, оцените количество молекул антибиотика на одну квантовую точку с помощью абсорбционной или флуоресцентной спектроскопии, гель-электрофореза или ИК-фурье-спектроскопии. На этом рисунке показаны типичные спектры поглощения и испускания квантовых точек до конъюгации с PMB, а также спектр испускания после добавления 160 молярных эквивалентов PMB.

Здесь показана зависимость между соотношением PMB и интенсивностью эмиссии квантовых точек (обозначена квадратами) и положением пика длины волны (обозначено треугольниками). При увеличении концентрации PMB интенсивность эмиссии КТ снижается, что приводит к смещению пика длины волны эмиссии. Следующая часть протокола выполняется вечером за два дня до эксперимента по конъюгации для определения полумаксимальной ингибирующей концентрации или IC 50 антибиотика и квантовой токсичности.

Внесите свежую колонию E. coli в 10 миллилитров среды LB для посева. На следующий день, за один-два часа до начала эксперимента, заполните каждую лунку прозрачного 96-луночного планшета. Планшет для анализа со средой для роста должен быть подготовлен так, как показано здесь.

Образцы следует высевать в трех повторностях, а концентрации антибиотиков должны охватывать достаточно широкий диапазон, чтобы включать одну концентрацию, которая оказывает минимальное ингибирующее действие на бактерии, и одну, которая полностью их уничтожает. Лунки, содержащие квантовые точки в концентрациях, которые будут использоваться в экспериментах с конъюгатами, также следует подготовить в трех повторностях. С помощью многоканального дозатора внесите в соответствующие лунки от 1 до 50 µL бактериальной культуры.

Концентрация будет зависеть от скорости роста конкретного штамма и потребует соответствующей калибровки. Для мониторинга роста поместите планшет в планшетный ридер и настройте считывание каждые 10 минут в течение двух часов при 600 нанометрах. Когда все клетки достигнут OD от 0.1 до 0.15, извлеките планшет из ридера и остановите запись.

Затем добавьте PMB в квантовых точках в соответствующие лунки и в трехкратной повторности закройте половину планшета алюминиевой фольгой. После этого поместите планшет под специальную лампу с длиной волны 440 nanometer, изготовленную из светодиодов мощностью 2.4 milliwatt, на 30 минут для облучения освещаемой стороны планшета. После светового воздействия поместите планшет в планшетный ридер и регистрируйте OD 600 каждые 10 минут в течение от пяти до 12 часов, в зависимости от скорости роста. По возможности с помощью программного обеспечения поддерживайте температуру ниже 32 degrees Celsius, чтобы избежать высыхания культур.

Постройте кривые роста в выбранный момент времени в зависимости от логарифма концентрации и определите IC 50 антибиотика, используя уравнение Хилла, представленное на экране, где H — коэффициент Хилла. Y max — это максимальная точка роста, а Y min — нулевая точка, также в идеале находящаяся на плато. По окончании периода регистрации прозрачные лунки будут указывать на полную гибель клеток, а при увеличении концентрации препарата должен наблюдаться градиент плотности клеток.

Бактерии должны демонстрировать S-образные кривые роста, как показано здесь. Положение максимального плато будет сильно различаться в зависимости от штамма, а также зависеть от температуры. В качестве репрезентативного можно выбрать определенный момент времени, а полученные значения отложить относительно log антибиотика для определения IC 50 с целью оценки квантовых точек.

Также можно построить график выживаемости в зависимости от логарифма концентрации квантовых точек, однако значительное уничтожение бактерий одними только квантовыми точками в используемой концентрации встречается редко. После определения токсичности квантовых точек и антибиотиков по отдельности тот же протокол можно применить для определения токсичности антибиотика. Показаны конъюгированные квантовые точки.

Ниже представлен пример схемы проведения анализа. Обратите внимание, что конъюгаты тестируют в возрастающих концентрациях в четырехкратных повторах; также следует включить контрольную полоску только с бактериями, полоску только с препаратом и лунки с образцами только с квантовыми точками. Затем показания OD 600 могут быть использованы для построения кривых роста, и я вижу значения IC50, как и прежде.

На этом рисунке показан пример конъюгатов, токсичность которых сопоставима с токсичностью одного антибиотика, и пример более токсичных конъюгатов. Чтобы определить количество колониеобразующих единиц или КОЕ для каждого условия, выберите одну или несколько лунок обработанного 96-луночного планшета для проведения подсчета колоний. Выполните серийное разведение каждой из выбранных проб бактерий в физиологическом растворе.

Для этого внесите пипеткой 180 µL физиологического раствора в соответствующие лунки. Перенесите 20 µL бактериального раствора и разбавьте его 180 µL физиологического раствора. Замените наконечник пипетки, перемешайте и перенесите 20 µL разбавленного бактериального раствора в 180 µL физиологического раствора.

Повторите этот процесс шесть раз. Затем возьмите по 10 µL из последних шести разведений и нанесите их каплями на прямоугольный планшет для автоматического посева. На одном прямоугольном планшете можно разместить 36 капель.

Оставьте планшет сохнуть на лабораторном столе в течение 15 минут, после чего инкубируйте его при 37 °C в течение 16 часов. Подсчитайте количество колоний для определения количества колониеобразующих единиц на миллилитр. Умножьте число колоний на коэффициент разведения и разделите на объем высева, чтобы определить влияние обработки на рост бактерий.

Плотность клеток E. coli измеряли по OD 600. Здесь представлены репрезентативные кривые роста бактерий при различных концентрациях препарата: от нуля до полной гибели клеток. Открытые символы соответствуют воздействию только PMB с указанными концентрациями.

Закрашенные символы обозначают образцы C-D-T-E-P-M-B без облучения, а полузакрашенные символы — образцы C-D-T-E-P-M-B с облучением. Облучение не оказало влияния на образцы, содержащие только PMB, поэтому для наглядности эти кривые были опущены. Здесь представлены графики значений кривой роста через 200 минут в зависимости от логарифма концентрации PMB, а также аппроксимации по данному уравнению для определения значений IC 50 с целью контроля эффектов света.

Кривая построена только для антибиотика при 30-минутном воздействии света. На этом рисунке показана выживаемость бактерий через 200 минут в зависимости от концентрации КТД с использованием CdTe КТД. При воздействии света наблюдается некоторая токсичность, однако её недостаточно для определения значения IC 50.

Это указывает на то, что токсичность самого CDTE в концентрациях, использованных в эксперименте по конъюгации, незначительна для сравнения эффектов различного воздействия на рост клеток. Значения кривой роста через 200 минут были построены и аппроксимированы по уравнению, представленному ранее, как показано здесь. Конъюгаты C-D-T-E-P-M-B оказались более токсичными, чем PMB сам по себе. Для сравнения, конъюгаты на основе золотых наночастиц A-U-P-M-B не показали повышения токсичности по сравнению с одним PMB при определении влияния препаратов на выживаемость бактерий.

Количество колониеобразующих единиц определяли для E. coli, посеянных в 96-луночный планшет, который подвергали воздействию P-M-B-Q-D-P-M-B или только QD с облучением или без него в течение 30 минут, после чего инкубировали при 32 °C в течение четырех часов. Серийные разведения каждого образца бактерий готовили в физиологическом растворе, и 10 µL растворов от 100x до 10⁷x высевали на чашки с агаром. Чашки инкубировали при 37 °C, подсчет колоний проводили через 16 часов.

В данном примере в колонках планшета с A по C находятся бактерии, обработанные возрастающими концентрациями CDTE. Конъюгаты без облучения и колонки с D по F представляют собой бактерии, обработанные возрастающими концентрациями конъюгатов. Вместе с 30-минутным облучением вдоль строк показаны разведения.

Данные указывают на то, что после облучения конъюгаты оказывают более сильное ингибирующее воздействие на рост бактерий по сравнению с конъюгатами без облучения. Не забывайте, что реагенты на основе ca крайне токсичны, и при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток, лабораторных халатов и защитных очков. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить высокопроизводительный скрининг антибактериального эффекта наночастиц с конъюгацией с антибиотиками или без нее.