Видео-окулография у мышей
19 июля 2012 г.
Видео-окулография очень количественный метод для исследования глазного производительность двигателя, а также в качестве моторного обучения. Здесь мы опишем, как для измерения видео-окулография у мышей. Применение этого метода на нормальный, фармакологически обработаны или генетически модифицированных мышей, является мощным инструментом исследования для изучения основных физиологии двигатель поведения.
Общая цель данной процедуры заключается в проведении видеоокулографии у мышей. Это осуществляется путем первоначальной установки на череп мыши конструкции пьедестала, которая позволяет зафиксировать голову животного в специальном фиксаторе головы и тела. На втором этапе мышь помещают в установку для видеоокулографии и проводят калибровку системы видеотрекинга зрачка.
Далее регистрируют движения глаз при активации окуломоторной системы с помощью широкого набора вестибулярных и оптикокинетических стимулов. Заключительным этапом является анализ этих движений глаз. В конечном счете, видео-окулография нормальных, фармакологически обработанных или генетически модифицированных мышей может быть использована для изучения физиологии моторного поведения.
Хотя данный метод позволяет получить представление о глазодвигательной системе, его также можно применять для изучения заболеваний церебеллярного, вестибулярного или окулярного происхождения, используя мутантных мышей, имитирующих патологии человека. Для начала процедуры анестезируйте мышь в газовой камере смесью изофлурана и кислорода. Затем поддерживайте анестезию, подавая газ через маску.
Затем с помощью нагревательной подушки и анального термодатчика поддерживайте температуру тела мыши на уровне 37 °C. После этого нанесите глазную мазь для защиты глаз от пересыхания, выбрейте шерсть в дорсальной области черепа и очистите операционное поле. Затем сделайте разрез по средней линии, чтобы обнажить дорсальную поверхность черепа, очистите и просушите её.
Затем нанесите одну каплю фосфорной кислоты из bgma на Lambda. Через 15 секунд удалите средство для травления, после чего очистите поверхность черепа физиологическим раствором и снова просушите ее. Нанесите одну каплю opti bond prime на верхнюю часть протравленной поверхности черепа и высушите струей воздуха.
Сушите в течение 30 секунд. Затем нанесите одну каплю адгезива OptiBond поверх праймера OptiBond. Полимеризуйте УФ-светом в течение одной минуты.
После этого покройте адгезивный слой тонким слоем композита Charisma. Коннектор с отверстием под магнитный винт и местами крепления встраивают в композит. Затем полимеризуйте композит с помощью УФ-света.
При необходимости повторно нанесите дополнительные слои композита и отвердите их с помощью света. Дайте мыши восстановиться в течение как минимум трех дней после операции. Следующим шагом является помещение мыши в фиксатор и закрепление ее головы в фиксаторе с помощью магнита и одного винта; установите фиксатор головы и тела мыши на XY-платформу.
С помощью платформы XY расположите голову мыши над центром поворотного стола таким образом, чтобы ее можно было перемещать по осям тангажа Ya и крена. Затем установите голову под нужным углом тангажа ya и крена, центрируя глаз по изображению, полученному с помощью системы сканирования глаза. Теперь поворотный стол подключен к двигателю с управлением через AC-сервопривод.
Положение поворотного стола контролируется с помощью потенциометра, закрепленного на оси стола. Поворотный стол закрыт цилиндрическим окружающим экраном с паттерном из случайных точек, который также оснащен двигателем с управлением через переменный ток (AC servo). Положение цилиндрического экрана контролируется потенциометром, закрепленным на его оси.
Экран может быть освещен галогеновой лампой. Движение поворотного стола и окружающего его экрана контролируется компьютером, подключенным к интерфейсу ввода-вывода. Сигналы положения поворотного стола и окружающего экрана фильтруются с частотой среза 20 hertz, оцифровываются интерфейсом ввода-вывода и сохраняются на этом компьютере.
Глаз мыши освещается тремя инфракрасными излучателями. Два из них закреплены на поворотном столе, а третий прикреплен к камере. Этот третий излучатель создает эталонный роговичный рефлекс, который используется при процедуре калибровки и во время регистрации движений глаз.
Инфракрасная ПЗС-камера, оснащенная зум-объективом, закреплена на поворотном столе и сфокусирована на голове мыши, находящейся в центре стола. Камеру можно разблокировать и перемещать по оси поворотного стола точно на 20 градусов.
В ходе процедуры калибровки видеосигнал обрабатывается системой айтрекинга, которая может отслеживать зрачок и опорное отражение от роговицы в горизонтальном и вертикальном направлениях с частотой дискретизации 120 hertz. Затем сигналы положения опорного отражения от роговицы, положения зрачка и размера зрачка оцифровываются интерфейсом ввода-вывода и сохраняются в том же файле, что и сигналы положения таблицы и окружающего экрана, чтобы откалибровать движения глаз, отрегулировать положение головы мыши относительно камеры таким образом, чтобы видеоизображение зрачка находилось в центре монитора, а отображение опорного отражения от роговицы располагалось на вертикальной осевой линии глаза непосредственно над зрачком.
Затем несколько раз переместите камеру на 20 градусов в пике относительно вертикальной оси поворотного стола. Используйте координаты отслеживаемого зрачка и корнеального референта, зафиксированные в крайних положениях камеры, для расчета радиуса вращения зрачка.
Повторите эти шаги многократно при различных условиях освещения, чтобы определить взаимосвязь между размером зрачка и его вращением. Затем постройте кривую коррекции вращения зрачка. Теперь рассчитайте угловое положение глаза, измерив контрольную позицию роговицы, положение зрачка и его размер.
Значение ротации зрачка может быть извлечено из кривой коррекции ротации зрачка, а угловое положение глаза может быть рассчитано с использованием следующей формулы. Здесь продемонстрирован эксперимент по изучению вестибуло-окулярного рефлекса (VVOR). Теперь преобразуйте положения глаза, положения таблицы и положения окружающего экрана в угловые координаты.
Затем дифференцируйте и отфильтруйте угловые положения стола и окружающего экрана с помощью низкочастотного фильтра Баттерворта. Используя частоту среза 20 hertz sub, удалите артефакты из сигнала скорости глаза, используя порог детектирования 40 градусов в секунду. Затем усредните сигналы скорости стола и глаза по каждому отдельному циклу в серии испытаний и аппроксимируйте усредненные сигналы соответствующей функцией.
Как правило, используется синусоидальная стимуляция скорости, а средние циклы аппроксимируются функцией синуса или косинуса. В данном видео показано, как движения глаз вызываются вращением окружающего экрана для возникновения оптокинетического рефлекса; экран вращается в диапазоне частот от 0.2 до 1 Гц с амплитудой 1.6 градуса. Показано, что оптокинетическая система мыши более эффективна в низкочастотном диапазоне, чем в высокочастотном.
Представляем еще одно видео, демонстрирующее механизм генерации движений глаз. При вращении мыши в темноте для вызывания вестибуло-окулярного рефлекса поворотный стол вращали в диапазоне частот от 0.2 до 1 Hz с амплитудой 1.6°. Показано, что вестибуло-окулярная система мыши более эффективна в высокочастотном диапазоне, чем в низкочастотном.
Здесь представлено еще одно видео, демонстрирующее, как генерируются движения глаз при вращении мыши на свету для вызова визуально усиленного вестибуло-окулярного рефлекса. При вращении поворотного стола в диапазоне частот от 0.2 до 1 Hz с амплитудой 1.6 градусов при интенсивном освещении окружающего экрана показано, что мышь генерирует эффективные компенсирующие движения глаз во всем диапазоне частот. На этом видео также показано, как осуществлялось моторное обучение путем адаптивного усиления вестибуло-окулярного рефлекса. При использовании парадигмы обучения в противофазе вращение поворотного стола в противофазе с окружающим экраном приводит к увеличению коэффициента VOR у этой мыши.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить видеоокулометрию у мышей.
Обзор
В данной статье описывается процедура проведения видеоокулографии у мышей — количественного метода исследования функций глазных двигательных нервов и моторного обучения. Этот метод может быть применен к здоровым, подвергнутым фармакологическому воздействию или генетически модифицированным мышам для изучения физиологии двигательного поведения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Окуломоторные функции
- Моторное обучение
Теоретическая справка
- Видеоокулография — это метод, используемый для изучения движений глаз.
- Данная методика позволяет получить сведения о функционировании окуломоторной системы.
- Ее также можно применять для изучения заболеваний мозжечкового или вестибулярного происхождения.
- Мышиные модели могут имитировать патологии человека для проведения исследований.
Цель исследования
- Измерение и анализ движений глаз у мышей.
- Изучение физиологических основ моторного поведения.
- Применение данного метода на различных моделях мышей для изучения заболеваний.
Используемые методы
- Установите мыши пьедестал для иммобилизации головы.
- Откалибруйте систему видеотрекинга зрачка.
- Зарегистрируйте движения глаз при воздействии вестибулярных и оптических стимулов.
- Проанализируйте зарегистрированные движения глаз для получения физиологических данных.
Основные результаты
- Успешная калибровка системы айтрекинга.
- Запись движений глаз при различных условиях стимуляции.
- Анализ данных, позволяющий получить сведения о физиологии моторного поведения.
- Применение метода для изучения заболеваний окуломоторной системы.
Выводы
- Видеоокулография является мощным инструментом для изучения движений глаз.
- Этот метод позволяет углубить понимание процессов моторного обучения и выполнения движений.
- Он обладает потенциалом для исследования заболеваний, поражающих окуломоторную систему.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Видеоокулография у мышей обеспечивает количественный поведенческий анализ для оценки окуломоторной функции, что позволяет снизить механические риски при работе с мишенями, задействованными в вестибулярных, мозжечковых и глазных моторных путях. Данный метод поддерживает валидацию мишеней, связывая генетические или фармакологические манипуляции с измеримыми изменениями рефлекторных движений глаз, что обеспечивает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска. Его применимость к релевантным моделям заболеваний расширяет трансляционную преемственность для разработки препаратов при нейропсихиатрических и нейродегенеративных расстройствах.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, направленные на вестибулярную, мозжечковую и окуломоторную системы, с помощью количественно определяемых поведенческих фенотипов.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимый, совместимый с высокопроизводительным скринингом метод анализа для поиска генетических и фармакологических модификаторов моторного поведения.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков путем изолирования функции окуломоторных цепей от мешающих моторных или мотивационных переменных.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные измерения зависимых переменных (скорость движения глаз, усиление, фаза), что дает возможность установить корреляцию «доза — ответ» и «генотип — фенотип».
- Практическая ценность: стандартизированные протоколы калибровки и отслеживания обеспечивают воспроизводимость результатов между различными лабораториями и готовность анализа к оценке соединений.
- Научная ценность: полученные данные способствуют снижению рисков при изучении механизмов, позволяя разграничить вклад вестибулярного, оптокинетического и визуально усиленного VOR в моторный контроль.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Система, релевантная заболеванию: мышиные модели, имитирующие вестибулярные, мозжечковые или глазные патологии человека, позволяют напрямую сопоставлять трансляционные биомаркеры.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность лонгитюдного мониторинга моторного обучения и адаптивной пластичности, что способствует доклинической валидации когнитивных и моторных терапевтических средств.
- Научная ценность: Облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков за счет количественной оценки функционального восстановления или прогрессирования дефицита в генетических моделях.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска в качестве инструмента фенотипического скрининга для валидации мишеней, результаты которого используются для идентификации соединений-лидеров и принятия решений о переходе к доклиническим исследованиям на основании целостности окуломоторной системы.
- Поиск новых биологических механизмов: Поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем изоляции вестибулярных и оптокинетических вкладов в управление движениями глаз.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной фиксации головы, калибровки и подачи стимулов, что позволяет проводить надежную оценку соединений или генотипов.
- Аналитика: Предоставляет количественные показатели (угловое положение глаз, скорость, коэффициент усиления), отфильтрованные и подогнанные под синусоидальные стимулы для сравнительного анализа в различных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями благодаря применимости к моделям заболеваний, что позволяет оценивать влияние терапии на фенотипы моторного поведения.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для кросс-функциональных групп, изучающих моторное обучение, нарушения равновесия и нейропсихиатрические показания.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в воздействии на мишень посредством измеримых изменений усиления и фазы VOR, OKR и VVOR.
- Операционная ценность: Стандартизированная хирургическая подготовка, иммобилизация головы и инфракрасный трекинг обеспечивают воспроизводимость между лабораториями и временными точками.
- Стратегическая ценность: Снижает биологический риск на поздних стадиях за счет обеспечения раннего обнаружения дисфункции двигательных цепей в генетических или фармакологических моделях.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем количественной оценки окуломоторных функций как биомаркера целостности нейронных цепей.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения операций на мышах, имплантации головных пластин и работы с системами инфракрасного отслеживания движений глаз.
- Необходимым является наличие специализированного оборудования, включая XY-платформы, сервоприводные поворотные столы, инфракрасные излучатели и высокоскоростные CCD-камеры.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима межгрупповая стандартизация хирургических протоколов, процедур калибровки и параметров стимулов.
- При адаптации метода следует учитывать особенности конкретной модели, включая линию мышей, вес и пигментацию глаз, влияющую на точность инфракрасного отслеживания.
- Практические ограничения включают время послеоперационного восстановления и возможные побочные факторы, такие как воздействие анестезии или воспаление, влияющие на базовую функцию окуломоторной системы.
