Контроль размера, формы и стабильность супрамолекулярных полимеров в воде

Общая цель следующего эксперимента заключается в контроле размера, формы и стабильности супермолекулярных динамических наночастиц в воде. Это достигается за счет создания самособирающихся или полимеризующихся дихотомических амплификаторов, молекулярная структура которых предусматривает как притягивающие, так и отталкивающие взаимодействия. Это приводит к возникновению механизма ограниченного роста, в результате чего в воде образуются самособирающиеся наночастицы с контролируемой сферической формой.

На втором этапе увеличивают концентрацию соли в водном растворе, что ослабляет силы отталкивания, заложенные в молекулярной структуре диско-амфифилов. Это индуцирует переход от сферической формы к стержневидной; для выявления механизмов данного перехода проводят исследования методом кругового дихроизма (CD-спектроскопии) в зависимости от температуры. Кроме того, для измерения и визуализации перехода от одного типа агрегатов к другому используют сочетание таких аналитических методов, как криогенная просвечивающая электронная микроскопия и ядерный магнитный резонанс. Полученные результаты показывают, что переход от сферы к стержню характеризуется усиленной кооперативностью в процессе супрамолекулярной полимеризации.

Это происходит при переходе от антикооперативного процесса в наночастицах ограниченного размера к полностью кооперативному механизму элонгации зародышей, который в данном случае приводит к образованию очень крупных супрамолекулярных полимеров — динамических наностержней. Основное преимущество сочетания таких спектроскопических методов, как КД-спектроскопия, малоугловое рентгеновское рассеяние и ЯМР, с микроскопическими методами, такими как криоэлектронная микроскопия, заключается в том, что это позволяет измерять и визуализировать переходы супрамолекулярных полимеров в воде. Эти динамические полимеры могут реагировать на внешние стимулы, такие как изменение температуры, изменение ионной силы или изменение pH.

Сочетание этих методов находит широкое применение и позволяет ответить на ключевые вопросы в области молекулярной химии и самособирающихся наноматериалов. Например, можно исследовать корреляцию между размерами агрегатов, образующихся при самосборке низкомолекулярных структурных блоков, и лежащими в основе этого процесса механизмами формирования. Возможности данной методологии распространяются на широкий спектр бионанотехнологических приложений.

Нас особенно заинтересовала область биомедицинской визуализации и разработка самособирающихся наночастиц в качестве контрастных веществ, где для успешного клинического применения первостепенное значение имеет тонкий баланс между стабильностью агрегатов, высоким контрастом и способностью организма выводить эти самособирающиеся контрастные вещества. Идея объединения методов анализа возникла у нас, когда мы осознали, что незначительные изменения в молекулярной структуре самособирающихся строительных блоков могут привести к фундаментальным различиям в механизме супрамолекулярной полимеризации. Процедуру продемонстрирует Пол Бомонт, эксперт и ответственный за работу криоэлектронных микроскопов в Техническом университете Трована.

Начните выполнение данного протокола с приготовления раствора BTA гадолиния-DTPA в 100 мМ цитратном буфере, как описано в письменном протоколе, сопровождающем данное видео. Заполните этим раствором кювету для УФ-спектрометра размером один сантиметр. Поместите кювету в держатель кювет на круговом дихроичном спектрометре.

Снимите CD-спектр в диапазоне от 230 до 350 нанометров. Затем измерьте кривую охлаждения CD на полосе с максимальной интенсивностью в диапазоне от 363 до 283 кельвинов со скоростью один кельвин в минуту. Затем добавьте такой же объем 2 M буферного раствора хлорида натрия к цитратному буферному раствору BTA gadolinium DTPA.

Это повысит ионную силу до 1 M NaCl и разбавит диски до половины исходной концентрации. После повышения ионной силы перемешайте раствор на вортексе в течение 40 секунд, затем повторно снимите КД-спектр в диапазоне от 230 до 350 нм. После этого измерьте кривую охлаждения КД на полосе с максимальной интенсивностью при понижении температуры от 363 до 283 K со скоростью 1 K в минуту.

Экспортируйте необработанные данные КД в программу Origin 8.5. Нормализуйте спектры, приняв эффект КД при максимальной измеренной температуре за ноль, а эффект КД при минимальной измеренной температуре за единицу. Поскольку величина эффекта КД пропорциональна степени агрегации, нормализованные кривые КД также пропорциональны степени агрегации. Нормализованные данные аппроксимируются с помощью функции нелинейной аппроксимации в Origin Pro 8.5 с использованием температурно-зависимой модели самосборки.

В данной модели различают режимы нуклеации и элонгации. Сначала определите степень агрегации в режиме элонгации. В данном уравнении T обозначает переменную температуру.

PHI N — это чистая спиральность, которая пропорциональна степени агрегации, а HE — молекулярная энтальпия удлинения. T TE представляет собой температуру удлинения, при которой самосборка начинает становиться термодинамически выгодной. Коэффициент нормализации fiat вводится для того, чтобы отношение Phi N к fiat не превышало единицы, что следует из ограничения, согласно которому степень агрегации не может быть превышена.

Аппроксимация по модели Unity позволяет определить энтальпию элонгации в джоулях на моль и температуру элонгации в кельвинах, которая характеризует самосборку молекул при данной концентрации. При аппроксимации следует соблюдать ограничение, согласно которому подгонке подлежит только степень агрегации при температурах ниже TE, поскольку уравнение применимо только в режиме элонгации; после аппроксимации первого уравнения единственным неизвестным параметром в уравнении режима нуклеации остается константа активации ka, которая описывает кооперативность супрамолекулярной полимеризации. Для определения константы активации проведите аппроксимацию экспериментально установленной степени агрегации при температурах выше TE в режиме нуклеации.

Начните с приготовления растворов для электронной микроскопии, как описано в тексте. Кратко: приготовьте два буфера — 100 мМ цитратный буфер и 100 мМ цитратный буфер с 5 М хлоридом натрия; растворите BTA gadolinium DTPA в 0,1 мл каждого из приготовленных буферов, чтобы достичь конечной концентрации 1 мМ. Затем обработайте плазмой сетку Quantifoil с углеродным покрытием, используя C Resington 2 0 8 carbon coer при силе тока 5 мА в течение 40 секунд.

Процедура витрификации является критически важным этапом криоподготовки, так как она обеспечивает формирование тонкого слоя глянцевого ISIS, подходящего для анализа TAM. Водный раствор наносится на сетку в процессе витрификации с использованием автоматизированного прибора FEI vitro bot. Эта процедура включает нанесение образца на сетку, удаление излишков жидкости путем промокания для создания тонкой пленки водного раствора на сетке и последующую витрификацию путем очень быстрого погружения сетки в жидкий Ethan.

После витрификации перенесите обработанную сеточку в жидкий азот для ее сохранения, затем вручную переместите сеточку с образцом в кассету автозагрузчика, которая также охлаждена жидким азотом. Следующим шагом является установка кассеты в автозагрузчик ТЕМ TUE cryo Titan. TUE Cryo Titan оснащен полевым эмиссионным источником, работающим при напряжении 300 киловольт.

Регистрация изображений TAM требует опыта и высокой скорости работы. Это обусловлено тем, что высокоэнергетический пучок электронов повреждает образец в процессе съемки. Регистрируйте изображения с помощью ПЗС-камеры, оснащенной послеколонным фильтром энергии. Поскольку гадолиний обладает сильными парамагнитными свойствами, что привело бы к значительному уширению протонных сигналов, использовался другой диск, в котором гадолиний был заменен диамагнитным иттрием и раствором BT atrium.

Приготовьте DTPA. Рассчитайте, сколько миллиграммов BT atrium DTPA с молекулярной массой 2,979 грамма на моль необходимо для достижения целевой концентрации 1 мМ. Растворите определенное количество BT atrium DTPA в 50 мМ дегазированном сукцинатном буфере в D₂O, после чего перенесите 0,6 миллилитра полученного раствора в NMR-пробирку Wilm LABS.

Поместите образец в соответствующий слот спектрометра Nova 500, оснащенного пятимиллиметровым зондом I-D-P-F-G от Varian. Выполните эксперименты DOI, как описано в тексте, предварительно записав стандартный протонный спектр ЯМР, адаптировав 90-градусный импульс и соответствующим образом оптимизировав время смешивания. Одноимпульсная последовательность DOI используется после определения коэффициента самодиффузии HDO в стандартном контрольном образце; затем в исследуемом образце определяется коэффициент диффузии агрегатов, на основе которого рассчитывается гидродинамический радиус.

Наконец, рассчитайте гидродинамические радиусы RH агрегатов, используя уравнение Стокса-Эйнштейна для диффузии сферической частицы. Ионный характер периферийных комплексов гадолиния с DTPA создает препятствие для одномерного роста дискообразных мономеров, ядро которых предназначено для полимеризации в вытянутые стержнеобразные агрегаты. Баланс между силами притяжения и отталкивания определяет размер и форму агрегатов.

Мощным методом определения размера и формы частиц и растворов является использование синхротронного источника. Малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР). Гадопентетат димеглюмина (Gd-DTPA) растворяли в цитратном буферном растворе, после чего регистрировали профили МУРР при двух различных концентрациях.

Наклон, приближающийся к нулю в области низких значений Q, указывает на отсутствие определенной формы и изотропию агрегата, что свидетельствует о наличии сферических объектов. Данные, измеренные при различных концентрациях, были аппроксимированы с использованием однородного монодисперсного сферического форм-фактора, что позволило рассчитать радиус, составивший 3.2 нанометра. Рассчитанный геометрический радиус мономерного диско-BTA гадолиния DTPA составляет 3.0 нанометра, что подтверждает наличие агрегатов с отношением сторон, близким к единице, и служит дополнительным доказательством сферической формы и нанометрового размера самособирающихся объектов.

Была проведена ЯМР-спектроскопия протонной диффузии. ЯМР-ДОС позволяет определять коэффициенты диффузии супрамолекулярных агрегатов, на основе которых можно рассчитать их гидродинамический радиус. Коэффициент диффузии агрегированного диамагнитного дихотичного амплификатора в дейтерированном сукцинатном буфере, определенный с помощью уравнения Стокса-Эйнштейна, составил 0,69 × 10⁻¹⁰ м²/с.

Для отдельных объектов сферической формы был рассчитан гидродинамический радиус, составивший 2,9 нанометра. Данный размер полностью согласуется со значением, полученным на основе данных SOX для BTA гадолиния DTPA. Дополнительное подтверждение успешного контроля длины одномерного стека было получено с помощью микрофотографий крио-ПЭМ.

BTA гадолиний-DTPA при концентрации 1 мM образует ожидаемые сферические объекты с диаметром около 6 нм, что подтверждает результаты измерений SAXS и DLS. На крио-ТЕМ микрофотографиях при высокой ионной силе отчетливо наблюдается образование супрамолекулярных полимеров в виде стержней с высоким аспектом. Наиболее вероятным объяснением данного явления является электростатическое экранирование.

Форма изменяется от сферического агрегата диаметром около шести нанометров до удлиненных стержней диаметром шесть нанометров и длиной до нескольких сотен нанометров. Здесь представлены спектры КД BTA Gadolinium DTPA при комнатной температуре с увеличением концентрации соли. Концентрация BTA gadolinium DTPA составляет 8 × 10⁻³ мМ при низкой ионной силе и 4 × 10⁻³ мМ при высокой ионной силе.

Несмотря на то, что для измерений КД используется значительно более низкая концентрация, выраженный «хлопковый эффект» указывает на наличие целых агрегатов даже при микромолярных концентрациях. Форма спектра КД изменяется при увеличении концентрации соли, что служит хорошим признаком ослабления сил взаимного отталкивания на периферии стопок и более плотной упаковки декос. Кроме того, кривые охлаждения КД для одних и тех же растворов демонстрируют отчетливые различия в форме.

Температура, при которой начинается агрегация, смещается в сторону более высоких значений при увеличении концентрации соли. Также становится очевиден усиливающийся кооперативный механизм, характеризующийся более резким увеличением эффекта КД, в то время как кривая охлаждения при нулевой молярности хлорида натрия лучше всего описывается изосферической моделью самосборки, указывающей на антикооперативный процесс. Кривая охлаждения при 1,0 молярном растворе хлорида натрия типична для кооперативного процесса самосборки и может быть описана моделью «нуклеация-удлинение», количественно определяющей термодинамические параметры самосборки BTA гадолиний-DTPA при нулевой и единичной молярности хлорида натрия.

Использование кооперативной модели наглядно демонстрирует снижение ka, которая представляет собой безразмерную константу активации. Более низкие значения KA указывают на более высокую степень кооперативности в процессе самосборки, что выражается в формировании сильно вытянутых супрамолекулярных полимеров. Как было замечено при крио-ПЭМ, при применении продемонстрированных экспериментальных методов важно помнить, что только сочетание экспериментальных подходов позволит получить содержательное общее описание исследуемых динамических наноматериалов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о широкой применимости нашего комбинированного экспериментального подхода и о том, как он может помочь в решении ключевых вопросов в области самособирающихся наноматериалов и суперполимеров.