Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Общая цель данной процедуры заключается в получении и характеристике T-лимфоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). ИПСК могут быть дифференцированы in vitro в культурной системе OP9 DL1 с последующим созреванием in vivo в мышах с дефицитом Rag. Также клетки могут быть генетически модифицированы для гиперэкспрессии TCR OT-I с последующим адаптивным переносом для развития in vivo.

После шести недель дифференцировки in vivo мышам можно ввести внутрибрюшинно опухолевые клетки EEG seven, после чего оценивают антигенную специфичность Т-клеток, полученных из иПСК. В конечном итоге иПСК могут дифференцироваться как в обычные, так и в антигенспецифические Т-клетки, последние из которых способны защищать животных от развития опухоли. Значение этого метода заключается в возможности индивидуализации иммунотерапии рака.

Данный метод позволяет получать большое количество опухоль-реактивных T-клеток из минимального объема крови или тканей кожи пациента. В день 0 переносят 5×10⁴ IPS-клеток в чашку для культивирования диаметром 100 мм, содержащую конфлюэнтный монослой клеток OP9 DL1 в среде alpha-MEM с 20% FBS. На 5-й день проводят трипсинизацию. После этого клетки центрифугируют, инкубируют в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C, затем высевают 5×10⁵ суспензионных клеток в среду alpha-MEM с 20% FBS и лигандом мышиного FLT3 в новую чашку диаметром 100 мм, содержащую монослой клеток OP9 DL1. На 8-й день осторожно собирают слабо прикрепленные клетки с помощью пипетирования, центрифугируют их и переносят в одну лунку 6-луночного планшета, покрытого конфлюэнтными клетками OP9 DL1. Клетки инкубируют при 37 °C и 5% CO2 еще в течение двух недель. На 22-й день.

Инкубируйте отделенные клетки IPS в свежей среде в новой культуральной чашке при 37 °C в течение 30 минут. Затем удалите примерно половину плавающих клеток и пропустите их через нейлоновый фильтр с размером пор 70 мкм для удаления клеточных агрегатов, а полученную суспензию одиночных клеток промойте трижды холодным PBS. После третьей промывки ресуспендируйте клетки в PBS до концентрации 1,5 × 10⁷ клеток/мл и храните их на льду до момента внутривенного введения.

Поместите четырехнедельную мышь с дефицитом Rag под инфракрасную лампу для расширения хвостовой вены. Затем наполните одномиллилитровый шприц с иглой калибра 26,5 200 µL клеточной суспензии и проведите адаптивный перенос клеток через расширенную хвостовую вену. Через три недели, после подтверждения эвтаназии мыши, которой был проведен адаптивный перенос, удалите лимфатические узлы и селезенку, после чего подвергните ткани механической гомогенизации.

Лизируйте суспензию одиночных клеток с помощью буфера для лизиса CK, затем дважды промойте полученные мононуклеары холодным PBS. После окрашивания на маркеры клеточной поверхности оцените клетки с помощью проточной цитометрии в нулевой день. В первый день используйте реагент для трансфекции генов JAMA для ночной трансфекции посеянных упаковочных клеток plat E с OT one MIDR. Во второй день посейте 1×10⁶ IPS-клеток в одну лунку 24-луночного планшета, предварительно покрытого 0,1% желатином. Соберите псевдовирус, содержащий S natin, из клеток plat E, после центрифугирования пропустите его через фильтр 0,4 мкм для удаления потенциальных загрязнителей. Проведите трансдукцию клеток в присутствии полибрена в течение одного часа при 330 ×g и 32 °C.

Инкубируйте их в течение ночи при той же температуре после повторения процедуры трансдукции. На четвертый день обработайте трансдуцированные ИПС-клетки трипсином, затем после центрифугирования ресуспендируйте осадок клеток в свежей среде и высейте их на предварительно подготовленные облученные фидерные клетки snl 7 6 7. После того как трансдуцированные клетки достигнут конфлюэнтности, выделите double-positive клетки по GFP и DsRed методом проточной цитометрии.

Через шесть недель после адаптивного переноса iPS-клеток, на 50-й день после введения опухоли, введите 50 µL клеток EEG seven thoma в брюшную полость той же мыши. Используйте набор для изоляции CD8-положительных T-клеток Miltenyi Biotec для выделения CD8-положительных T-клеток из селезенки и лимфатических узлов животного, которому был произведен адаптивный перенос. Смешайте изолированные CD8-положительные T-клетки с облученными спленоцитами от наивной мыши C57BL/6J в соотношении 1:10 и проведите пульс-стимуляцию кокультуры 0,5 µmol/mL OVA в течение 40 часов.

После этого добавьте felden A к клеткам еще на четыре часа. В завершение оцените популяции клеток с помощью проточной цитометрии. После выделения SP-клеток из наивной мыши C 57 black six J разделите клеточную суспензию на две группы.

Пометьте группу с высоким содержанием CFSE, используя 5 µM CFSE, и проведите пульс-стимуляцию клеток 10 µg/mL OVA-пептида в течение одного часа; группу с низким содержанием CFSE пометьте 0,5 µM CFSE без проведения пульс-стимуляции. Смешайте в PBS 2,5 × 10⁶ клеток с высоким содержанием CFSE и 2,5 × 10⁶ клеток с низким содержанием CFSE. Затем проанализируйте экспрессию CFSE в клетках методом проточной цитометрии.

Через 16 часов после адаптивного переноса подопытной мыши. Для подсчета числа опухолевых клеток в брюшной полости на 20-й день после введения опухоли используйте шприц объемом 10 мл с иглой калибра 18,5 и холодный PBS для промывания брюшной полости. Подсчитайте количество полученных опухолевых клеток для идентификации инфильтрирующих опухоль клеток.

Удалите опухоль на поздней стадии развития и разрежьте ее на три части. Поместите первый фрагмент опухоли в криопробирку и установите пробирку на сухой лед. Второй фрагмент немедленно зафиксируйте формальдегидом.

Поместите третий фрагмент в кондиционированную среду RPMI 1640 после высушивания криоконсервированных срезов ткани на воздухе. Зафиксируйте их в холодном ацетоне в течение 15 минут, предварительно высушив фиксированные срезы на воздухе еще в течение 15 минут. После этого промывайте предметные стекла в PBS в течение пяти минут.

Поместите предметные стекла в увлажненную камеру и накройте срезы тканей 30 µL смеси 3%B, SA и PBS на 30 минут для блокирования неспецифического связывания. Затем удалите блокирующий буфер с помощью фильтровальной бумаги и инкубируйте срезы тканей в увлажненной камере в течение двух часов с использованием 50 µL смеси антител pe anti TCR RV alpha two и fitzy anti ova, разведенных в 3%PSA в PBS. По окончании инкубации промойте стекла трижды в холодном PBS, после чего закройте срезы водным заключающим средством перед исследованием под флуоресцентным микроскопом для проточного цитометрического анализа опухоль-инфильтрирующих Т-клеток.

Разотрите опухоль до получения суспензии единичных клеток. Затем проанализируйте клетки на наличие специфических поверхностных маркеров. Для идентификации T-клеток использовались маркеры CD3 и TCR$\beta$. Было проведено исследование того, может ли стимуляция ИПС-клеток лигандом Notch DL1 способствовать экспрессии CD4 и CD8 на поверхности CD3-положительных и TCR$\beta$-положительных клеток, производных от ИПС-клеток.

Обратите внимание на точечный график справа, на котором показаны одиночно положительные T-клетки CD3-положительные TCR $\beta$-положительные CD4-отрицательные CD8-положительные, полученные из IPS-клеток in vitro на 22-й день. Кроме того, одиночно положительные клетки, производные от IPS-клеток с предыдущего рисунка, вырабатывали интерлейкин 2 и интерферон гамма при стимуляции in vitro антителами к CD3, нанесенными на планшет, и растворимыми антителами к CD28, что подтверждает функциональность T-клеток, производных от IPS-клеток, после адаптивного переноса в мышей-реципиентов. Большинство трансдуцированных геном TCR IPS-клеток дифференцировались в CD8-положительные CTL, которые реагировали in vitro на пептидную стимуляцию секрецией интерлейкина 2 и интерферона гамма, что видно на данных точечных графиках для объединенного пула клеток лимфатических узлов и селезенки.

T-клетки, CD8-положительные и Vβ5-положительные, были получены у мышей, которым проводили адаптивный перенос IPS-клеток, трансдуцированных TCR, но не у мышей, получивших контрольные трансдуцированные клетки. Популяции CD8-положительных Vβ5-положительных клеток были положительными при внутриклеточном цитокиновом окрашивании на продукцию интерлейкина 2 и интерферона гамма, что на данных гистограммах представлено темными линиями по сравнению с закрашенными гистограммами изотипического контроля, что указывает на функциональность CTL, производных от IPS-клеток. Эти данные показывают, что клетки с высоким содержанием CFSE, пульсированные эпитопом, представлены пиками справа на каждом графике, а контрольные клетки с низким содержанием CFSE представлены пиками слева; данные клетки вводились мышам через 10 недель после переноса IPS-клеток или через один день после переноса OT-I CTL.

CTL, полученные из антигенспецифических IPS, реагировали на стимуляцию антигеном и проявляли цитотоксическую активность, о чем свидетельствует отсутствие здесь клеток с высоким уровнем CFSE. IPS-клетки, трансдуцированные геном TCR OT-I, были адоптивно перенесены мышам C57BL/6, после чего мышей подвергли воздействию опухолевых клеток EAT7; на 20-й день был проведен подсчет опухолевых клеток в брюшной полости. Обратите внимание на значительное снижение количества опухолевых клеток у мышей, получивших трансдуцированные TCR IPS, по сравнению с контрольными группами.

Что наиболее важно, адаптивный перенос TCR-трансдуцированных ИПС-клеток вызвал инфильтрацию гиперактивных ЦТЛ в опухолевые ткани и защитил животных от опухолевого воздействия, что видно на данном окрашивании опухолевых тканей гематоксилином и эозином, полученных через 30–35 дней после введения опухолевых клеток; опухоли наблюдались у мышей, которым были адаптивно перенесены имитированные контрольные клетки или контрольная группа, но не у мышей, получивших TCR-трансдуцированные клетки или ЦТЛ OT-1. В трансдуцированные клетки инфильтрировали воспалительные клетки, на что указывают красные стрелки. Было обнаружено, что Ova-специфические Vα2-положительные ЦТЛ (красный цвет) инфильтрируют экспрессирующие Ova опухолевые ткани (зеленый цвет).

Хотя в опухолях мышей из контрольных групп на данном рисунке наблюдалось меньше инфильтрирующих опухоль клеток или их полное отсутствие, суспензии одиночных клеток из тканей опухолей анализировали методом проточной цитометрии на экспрессию V alpha two и V beta five после гейтирования по популяции CD eight положительных клеток. Обратите внимание, что в тканях опухолей мышей, которым были адаптивно перенесены TCR-трансдуцированные IPS-клетки, наблюдался самый высокий уровень инфильтрации опухоли, в то время как в опухолях мышей, получивших контрольные трансдуцированные IPS-клетки, инфильтрация ova-специфическими CD eight положительными T-клетками отсутствовала.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как генерировать антигенспецифичные T-клетки из ИПС-клеток и как оценивать функции T-клеток, полученных из ИПС.