Визуализация и анализ потока крови и потребления кислорода в печеночной микроциркуляции: применение к модели острого гепатита

Была разработана оптическая система для визуализации микроциркуляции в печени с использованием флуоресцентно-меченных эритроцитов и для измерения парциального давления кислорода в микрососудах методом лазерной фосфорной визуализации. Данный метод может быть использован для исследования физиологических и патологических механизмов путем анализа структуры микрососудов, их диаметра, скорости кровотока и напряжения кислорода. В микроциркуляции печени кровь течет от портальных синусоидов к центральным синусоидам, создавая между ними градиент кислорода.

Концентрация кислорода в печени влияет как на экспрессию ферментов, так и на патологические процессы, что делает анализ кровотока и измерение уровня кислорода важными темами исследований. Наш экспериментальный метод включает внутривенное введение эритроцитов, меченных флуоресцентным красителем.

Для визуализации микроциркуляции с использованием флуоресценции при измерении парциального давления кислорода мы внутривенно вводим палладиновый порфирин, который при лазерном возбуждении в кровотоке испускает фосфоресценцию, интенсивность которой зависит от концентрации окружающего кислорода. Этот процесс позволяет проводить количественный анализ кислорода; измерение парциального давления в микроциркуляции печени показало, что парциальное давление кислорода в портальной и центральной венах составило 59.8 и 38.9 миллиметров ртутного столба соответственно, что подтверждает эффективность измерения концентрации кислорода. Далее мы применили данную методологию к модели гепатита.

Мы обнаружили повышенное парциальное давление кислорода в портальных синусоидах и центральных венах, но снижение разности давлений между портальными и центральными венами. Вероятно, это обусловлено снижением потребления кислорода в области центральных вен вследствие некроза гепатоцитов. Эти результаты показывают, что наша методика использования оптической системы для измерения печеночной гемодинамики и потребления кислорода позволяет выяснить механизмы различных заболеваний печени в системе печеночного микроциркуляторного русла.

Градиент кислорода является важным параметром, влияющим на экспрессию ферментов в перипортальных и парацентральных зонах, а также на развитие различных видов заболеваний печени, связанных с микрораспределением, поэтому количественное определение кровотока и потребления кислорода имеет большое значение. Для выяснения этих механизмов преимущество нашего метода заключается в возможности бесконтактного и непрерывного оптического измерения, что позволяет количественно определить кровоток, диаметры сосудов и градиент кислорода в микроциркуляции печени. Из мыши-донора была отобрана цельная кровь, после чего эритроциты дважды промывали PBS путем центрифугирования при 400 G в течение пяти минут.

Затем растворите 2 mg FITC в 1 ml 100 mM деионизированного гидрофосфата натрия, после чего профильтруйте раствор через мембрану с размером пор 0,2 micron. Затем поместите в пробирку 1 ml раствора FITC, 0,15 ml 3 mM раствора декстрана, 0,25 ml 180 mM деионизированного гидрофосфата натрия и 1,5 ml 100 mM деионизированного гидрофосфата натрия, и осторожно перемешайте. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение двух часов, после чего дважды промойте окрашенные эритроциты раствором PBS.

Затем нанесите небольшое количество суспензии эритроцитов на предметное стекло и убедитесь в нормальном внешнем виде эритроцитов и достаточной флуоресценции. Суспендируйте 0,1 мл эритроцитов в 0,9 мл PBS и храните при температуре 4 °C до использования. Далее растворите 500 мг BSA в 10 мл PBS. Затем добавьте 30 мг порфирина палладия и перемешивайте в течение ночи. Центрифугируйте раствор, чтобы удалить нерастворенный порфирин палладия, и профильтруйте супернатант через мембрану с порами 0,2 мкм. Раздайте по 1 мл фильтрата в пробирки и храните при температуре -20 °C, стараясь избегать повторного замораживания и оттаивания.

Для микроскопической визуализации микроциркуляции прорежьте в пластине отверстие диаметром 20 millimeter и закройте его квадратным покровным стеклом со стороной 30 millimeters. После канюлирования хвостовой вены разложите основную долю печени на пластине в положении на животе. Затем используйте несколько фрагментов пищевой пластиковой пленки размером three millimeter на eight millimeter, чтобы закрыть область вокруг доли, предотвращая ее высыхание и смещение при дыхании.

Визуализируйте печеночное кровообращение с помощью просвечивающего микроскопа и убедитесь в отсутствии стаза кровотока в поле зрения в течение как минимум 15 минут. Для наблюдения за кровотоком постепенно введите 0,2 мл флуоресцентно меченных эритроцитов.

Для измерения парциального давления кислорода введите 0,2 milliliters раствора палладинового порфирина. Эритроциты, меченные FITC, будут составлять одну пятидесятую часть от всех циркулирующих эритроцитов в визуализируемой области; возбудите FITC, облучая его светом ртутной лампы, прошедшим через полосовой фильтр с диапазоном от 450 до 490 nanometer, и зарегистрируйте флуоресценцию с помощью ПЗС-камеры. Фосфоресценция палладинового порфирина относительно слабая, поэтому требуется высокочувствительный детектор и затемненное помещение.

Пики поглощения порфирина палладия находятся в области 410 и 532 нанометров, в связи с чем рекомендуется использовать длину волны второй гармоники 532 нанометров. Данная длина волны генерируется импульсным неодимовым YAG-лазером; лазерный луч подключают к инвертированному микроскопу и настраивают таким образом, чтобы луч освещал центр фокальной плоскости. Пространственное разрешение лазера зависит от размера пятна, который можно отрегулировать, пропуская луч через диафрагму (пинхол).

Для детектирования фосфоресценции также прикрепите к микроскопу длинноволновой фильтр и фотоэлектронный умножитель. ФЭУ должен быть чувствителен к красной области спектра, особенно в районе 700 нанометров. Зарегистрируйте сигнал фосфоресценции и рассчитайте постоянную времени затухания, применив экспоненциальную функцию.

В данном эксперименте мы провели выборку 500 точек при частоте 200 килогерц. Для калибровки приготовьте два раствора порфирина палладия с парциальным давлением кислорода 150 и 0 миллиметров ртутного столба соответственно. В раствор с давлением 0 миллиметров ртутного столба добавьте 1% дигидрогена, чтобы создать условия отсутствия кислорода во время калибровки.

Поддерживайте pH образца на уровне 7.4 и температуру 37 °C. Поместите мышь на предметный столик микроскопа и совместите микрососуды, в которых вы хотите визуализировать печеночную микроциркуляцию, с точкой лазерного луча. Мышей с неограниченным доступом к воде в течение ночи подвергли внутрибрюшинному введению ацетаминофена в дозе 200 mg/kg. Через 24 часа после инъекции мышь анестезируют и обнажают печень с помощью срединного разреза. При наличии гепатита он будет легко заметен невооруженным глазом по некрозу в парацентральной области.

Наши измерения парциального давления кислорода в микрососудах печени мышей показали, что среднее давление кислорода в портальных венах, синусоидах и центральных венах составило 59,8, 48,2 и 38,9 мм рт ст соответственно. Другими словами, градиент кислорода от портальных вен к центральным венам указывает на достаточный выход кислорода из эритроцитов при их прохождении через синусоиды. Для измерения параметров микрососудов печени мы использовали мышей с моделью гепатита, индуцированного ацетаминофеном.

В качестве примера патологической модели мы обнаружили, что парциальное давление кислорода в воротной вене, синусоидах и центральных венах было выше в группе, получавшей ацетаминофен, по сравнению с нормальными мышами. Разница парциального давления кислорода между воротной и центральной венами составила 20.9 мм рт ст для нормальных мышей и 16.9 мм рт ст для мышей с моделью гепатита. Разница парциального давления кислорода между воротной и центральной венами составила 20.9 мм рт ст для нормальных мышей и 16.9 мм рт ст для мышей с моделью гепатита.

Градиент кислорода в микроциркуляции печени возникает главным образом из-за подачи кислорода из воротной вены, который потребляется гепатоцитами; некроз гепатоцитов в области центральной вены, вызванный ацетаминофеном, приводит к снижению потребления кислорода, нарушению нижележащей микроциркуляции и, следовательно, к проблемам, связанным с гемодинамикой. Подача и потребление кислорода задействованы при многих формах заболеваний печени. Мы создали модель острого гепатита и обнаружили повышение парциального давления кислорода в микрососудах.

Наша оптическая система может быть использована для исследования физиологических и патологических механизмов путем анализа структуры микроциркуляторного русла, а также распределения кровотока и потребления кислорода.