Планарии иммобилизации, частичное облучение, и тканей
6 августа 2012 г.
Эффективный метод для пересадки ткани определенной и последовательной размер между планарии описано. Также имеется описание того, как иммобилизация метод, используемый для трансплантации могут быть адаптированы в сочетании с ведущим щиты, для частичного облучения животных.
Общая цель следующего эксперимента заключается в том, чтобы расположить популяцию здоровых стволовых клеток рядом с тканью, в которой стволовые клетки были уничтожены, внутри планарии для анализа поведения стволовых клеток и их потомков in vivo в процессе регенерации. Это достигается путем анестезии и иммобилизации не облученной или облученной лучами Leafly планарии для дальнейших манипуляций. Затем иммобилизованная не облученная планария частично экранируется свинцом и подвергается рентгеновскому облучению, в результате чего получается невредимая планария, в которой ткань с уничтоженными стволовыми клетками соседствует с экранированной тканью, сохранившей популяцию стволовых клеток.
В качестве альтернативы, трансплантат ткани, взятый от необлученного донора, может быть пересажен ранее облученному реципиенту для создания химеры с изолированной популяцией стволовых клеток. В результате получения организма, в котором в остальном отсутствуют стволовые клетки, наблюдаются изолированные популяции стволовых клеток, прилегающие к тканям с аблированными стволовыми клетками, что подтверждается методом гибридизации RNA in situ на целых препаратах с использованием маркерных генов стволовых клеток.
Описанные здесь методы направлены на более глубокое изучение регенерации планарий путем анализа поведения стволовых клеток как в парадигме трансплантации, так и в парадигме частичного облучения, что позволяет проверить, влияют ли окружающие ткани и локальная среда, в которой находятся эти стволовые клетки, на поведение этих необластов или стволовых клеток. В процессе подготовки, за один-два месяца до начала эксперимента, кормите планарий в соответствии с прилагаемой рукописью. Для данной демонстрации отбирают планарий длиной от 1 до 2 см и шириной более 2 мм, чтобы достичь требуемого размера.
Затем животных подвергают голоданию в течение трех-семи дней перед использованием. Далее готовят раствор хлортона — мягкого местного анестетика, растворяя 0,1–0,2% (масс./об.) хлортона в воде. Затем раствор охлаждают на льду. Для трансплантации ткани с помощью горелки Бунзена изгибают капиллярную трубку с внутренним диаметром 0,75 мм под углом 90 градусов на расстоянии одного-двух сантиметров от конца для отсечения трансплантата ткани.
Затем согните другую капиллярную трубку с внешним диаметром 0,7 миллиметра на расстоянии одного-двух сантиметров от конца под углом 90 градусов, чтобы создать в хозяине отверстие для принятия трансплантата. Далее вырежьте из черной фильтровальной бумаги Whatman номер 3, салфеток Kimwipe и бумаги для самокруток фрагменты соответствующих размеров, указанных в сопроводительной рукописи.
После этого приготовьте модифицированный раствор Холта-Ферса и насыщенный раствор Кейна-Холта-Фреттера. Охладите оба раствора до 4 °C. Затем прикрепите сложенную салфетку Kimwipe к квадрату из параформа.
Поместите образец на пластину охладителя Пельтье или другое охлаждающее устройство под стереомикроскопом. Затем пропитайте салфетку Kim охлажденным раствором Холта-Фреттера. После этого положите две прямоугольные полоски черной фильтровальной бумаги на салфетку Kim.
Теперь поместите кусочек фильтровальной бумаги Whatman № 2 в чашку Петри. Увлажните фильтровальную бумагу раствором Холта-Фреттера. Затем охладите чашку на льду для частичного облучения.
Поместите бумажный фильтр большего размера в подходящую по размеру чашку, аналогично процедуре трансплантации тканей. Увлажните фильтровальную бумагу раствором Холта-Фреттера. Затем охладите чашку на льду.
В данной процедуре наполните чашку Петри охлажденным раствором клеона. Перенесите планарию в чашку с помощью пипетки для трансплантации. Анестезируйте только одного реципиента и одного донора одновременно.
Для частичного облучения можно одновременно анестезировать большое количество животных. Затем оставьте парий вымачиваться в растворе клеона от 5 до 10 минут, пока они не станут неподвижными. Промойте парий, перенося их пипеткой в чашку с охлажденным раствором Холта-Фреттера.
После этого иммобилизируйте область плини, перенося их пипеткой на черную фильтровальную бумагу, насыщенную охлажденным раствором Холта-Фреттера. Затем с помощью пинцета расположите их брюшной стороной вниз. Теперь поместите заранее подготовленную охлажденную чашку Петри в ведро со льдом, которое помещается внутрь источника рентгеновского облучения X-ray.
Расположите анестезированных планарий в чашке Петри, перемещая черные фильтровальные бумаги. Затем перенесите их в верхний источник рентгеновского облучения, установив ведро со льдом таким образом, чтобы расстояние от катодной трубки до планарий было минимальным. Это позволит максимально увеличить эффективную мощность дозы.
Затем расположите свинцовые экраны между парией и катодной трубкой для дозирования рентгеновского излучения. Если требуется полное уничтожение стволовых клеток в неэкранированных областях, облучайте дозой 30 grays или более. Сразу после рентгеновского облучения перенесите парию в охлажденную воду для парии.
После этого дайте парианской воде нагреться до комнатной температуры, чтобы животные сами отделились от черной фильтровальной бумаги. Процедура частичного облучения завершена. Чтобы начать выполнение этой процедуры под диссекционным микроскопом, расположите области пластов анестезированного реципиента и донора на отдельных прямоугольных черных фильтрах, лежащих на салфетке Kim wipe, которая была предварительно охлаждена на охладителе Пельтье или охлаждающей пластине.
Используйте капиллярную трубку с внутренним диаметром 0.75 мм, чтобы вырезать трансплантат из донорского образца. Затем с помощью пинцета поместите его на свободный участок реципиента. После этого используйте капиллярную трубку с внешним диаметром 0.7 мм, чтобы удалить фрагмент ткани из реципиента.
Затем поместите трансплантат в отверстие. Перенесите пересаженную особь с прямоугольной черной фильтровальной бумаги в предварительно подготовленную чашку Петри. Смочите кусочек папиросной бумаги раствором Холта-Фреттера, насыщенным каином.
Затем поместите его поверх пересаженного хозяина. Далее пропитайте четыре кусочка фильтровальной бумаги насыщенным раствором Холтера, а в случае использования пересаженного хозяина в субстрате — пропитайте четыре клочка разрезанной салфетки Kimwipe насыщенным раствором Холт-Фреттера. Разложите их поверх фильтровальной бумаги.
После этого закройте крышку. Поместите чашку Петри на лед. Затем перенесите донорское животное в воду для восстановления и регенерации.
После завершения всех пересадок поместите пересаженный париан в инкубатор при температуре 10 °C на ночь. На следующее утро перенесите его в чашку Петри, наполненную водой для париана. Дождитесь, пока париан самостоятельно отделится от фильтровальной бумаги, или осторожно удалите его с помощью пинцета, после чего заменяйте воду для париана один раз в два-три дня.
Гибридизация in situ на срезах облученного, но полностью экранированного контрольного экземпляра parian, фиксированного через три дня после облучения, демонстрирует распределение стволовых клеток, которое не отличается от распределения у parian дикого типа. С другой стороны, у экземпляра parian, который был экранирован лишь частично, при этом передняя и задняя части оставались открытыми, стволовые клетки в неэкранированных областях, по-видимому, подверглись абляции. Здесь представлены дорсальный и вентральный виды успешно трансплантированного экземпляра parian.
Через три дня после трансплантации трансплантат отчетливо виден как на дорсальной, так и на вентральной поверхностях; он окружен характерной непигментированной тканью на границе раздела трансплантата и реципиента. Однако при неудачной трансплантации в месте введения видимых тканей трансплантата не обнаруживается. Гибридизация in situ всего препарата выявила наличие стволовых клеток только в области трансплантата или вокруг нее, что при условии правильного освоения методики свидетельствует об успешности трансплантации.
Каждая трансплантация может быть выполнена всего за пять минут. При показателях успеха, приближающихся к 90–100%, масштаб частичного облучения можно значительно увеличить, при условии, что размер рабочего поля вашего иррадиатора достаточно велик.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод пересадки тканей определенного размера между планариями с использованием техники иммобилизации для трансплантации. Метод также позволяет проводить частичное облучение живых животных с помощью свинцовых экранов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Регенеративная биология
- Исследования стволовых клеток
Теоретическая часть
- Понимание поведения стволовых клеток в процессе регенерации имеет решающее значение.
- Планарии служат модельным организмом для изучения регенерации.
- Предыдущим методам не хватало точности при пересадке тканей.
- Методы частичного облучения могут влиять на динамику стволовых клеток.
Цель исследования
- Для анализа поведения стволовых клеток и их потомства in vivo в процессе регенерации.
- Для разработки надежного метода трансплантации тканей у планарий.
- Для изучения влияния облучения на популяции стволовых клеток.
Используемые методы
- Анестезия и иммобилизация планарий для проведения манипуляций.
- Использование свинцовых экранов для частичного облучения тканей.
- Трансплантация тканевых графтов от необлученных доноров облученным реципиентам.
- Применение метода гибридизации РНК in situ на целых препаратах для анализа.
Основные результаты
- Успешная пересадка тканей определенных размеров между планариями.
- Изоляция популяций стволовых клеток, прилегающих к аблированным тканям.
- Продемонстрированное влияние облучения на поведение стволовых клеток.
- Полученные данные о динамике стволовых клеток в процессе регенерации.
Выводы
- Разработанный метод повышает точность при трансплантации тканей.
- Частичное облучение может быть эффективно использовано для изучения взаимодействий стволовых клеток.
- Полученные результаты способствуют пониманию регенеративных процессов у планарий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Частичное облучение планарий и трансплантация тканей позволяют проводить точный анализ поведения взрослых стволовых клеток in vivo, что способствует механистическому снижению рисков на ранних этапах поиска. Эти методы облегчают изоляцию и функциональное тестирование субпопуляций стволовых клеток, напрямую влияя на валидацию мишеней и анализ путей регенерации. Широкое внедрение этих масштабируемых протоколов повышает прогностическую достоверность в ключевых точках принятия решений в портфелях исследований и разработок в области регенеративной медицины и стволовых клеток.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет провести функциональный анализ гетерогенности стволовых клеток и их регенеративного потенциала.
- Способствует механистическому снижению рисков путем изоляции клеточно-автономных и неавтономных факторов.
- Облегчает проверку гипотез относительно регенеративных мишеней в доступной системе in vivo.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимую подготовку моделей планарий для последующих функциональных анализов.
- Стандартизирует рабочие процессы частичного облучения и трансплантации для получения количественных данных.
- Позволяет масштабировать получение животных для высокопроизводительных исследований по репопуляции или абляции.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям трансляционных биомаркеров, обеспечивая возможность отслеживания судьбы стволовых клеток in vivo.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации механизмов регенерации.
- Снижает биологическую неопределенность в моделях восстановления тканей с использованием стволовых клеток.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данные протоколы позволяют использовать модели планарий в качестве связующего звена — от этапа первичного поиска до идентификации перспективных соединений в исследовательских циклах по изучению регенерации и стволовых клеток.
- Фундаментальная биология: Изоляция и исследование субпопуляций стволовых клеток для выяснения механизмов регенерации.
- Скрининг: Создание стандартизированных воспроизводимых моделей для количественной оценки функций стволовых клеток.
- Аналитика: Возможность проведения гибридизации in situ в целом препарате для пространственно-разрешенного анализа маркеров стволовых клеток.
- Трансляционные исследования: Платформа для оценки клеточно-автономных и средовых факторов, влияющих на регенерацию.
- Корпоративное использование: Разработка масштабируемых высокоэффективных протоколов для многократного применения в программах по биологии регенерации.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней в стволовых клетках и изучении механизмов регенерации.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость, масштабируемость и пропускную способность функциональных анализов in vivo.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает принятие надежных решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) за счет снижения неопределенности механизмов на ранних стадиях программ.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию кандидатов для регенеративной терапии и терапии стволовыми клетками с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с планариями, включая навыки их иммобилизации и методы микродиссекции.
- Необходим доступ к оборудованию для рентгеновского облучения и свинцовому экранированию для проведения частичной абляции.
- Требуются стандартизированные протоколы для обеспечения воспроизводимости результатов между разными исследовательскими группами и сопоставимости данных.
- Адаптация метода для других модельных систем может потребовать оптимизации и валидации протокола.
- Пропускная способность ограничена этапами ручного выполнения, хотя протоколы оптимизированы для повышения эффективности и масштабируемости.
