Подготовка T фактор роста клеток от Крыса Спленоциты

Здравствуйте, меня зовут Кристин Битон. Я помощник-исследователь в лаборатории Джорджа Чена на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвине. В течение следующих двух дней я покажу вам, как приготовить TCGF, что означает фактор роста Т-клеток.

Для повседневного культивирования клеток, когда нам не требуется точное знание состава цитокинов в питательной среде, мы используем фактор роста Т-клеток (TCGF), который представляет собой супернатант культуры селезенки, содержащий цитокины, необходимые для экспансии Т-клеток. TCGF готовится следующим образом: после усыпления здоровых крыс линии Lewis мы извлекаем их селезенки, готовим суспензию единичных клеток, удаляем эритроциты путем лизиса, после чего стимулируем мононуклеарные клетки конканавалином А, что индуцирует выработку Т-клетками всех необходимых для их роста цитокинов. Для получения TCGF необходимо активировать клетки.

Мы вводим лектин Con A (сокращенно Concanavalin A) в культуру клеток. При добавлении Con A в клеточную культуру он связывается с гликозилированным комплексом Т-клеточного рецептора, и одновременное связывание с несколькими комплексами приводит к процессу, называемому «кэппингом» (образованием «шапочки»). В результате происходит агрегация рецепторов на поверхности клетки, что вызывает сигнал активации Т-лимфоцитов.

После активации клеток начинается процесс бластирования. Клетки увеличиваются в размере, после чего начинают секретировать цитокины. Первоначально считалось, что TCGF представляет собой главным образом интерлейкин 2, однако теперь известно, что это не совсем так.

Он также содержит интерферон гамма, ТНФ-альфа и, вероятно, цитокины в очень малых количествах, которые необходимы лишь для поддержания жизнеспособности клеток. Через 48 часов культивирования клетки вырабатывают все необходимые нам цитокины. Поэтому мы удалим клетки; когда клетки будут удалены и останется только супернатант, в нем всё еще будет присутствовать свободный конал. Это станет проблемой, так как нам необходимо использовать наш фактор роста Т-клеток для поддержания роста линий Т-клеток.

Если оставить конкавалин А в свободном виде, он активирует клетки тогда, когда нам это не нужно. Чтобы решить эту проблему, мы добавим избыток сахара, который свяжет весь свободный конкавалин А. Таким образом, он будет полностью инактивирован и не будет связываться с другими гликозилированными рецепторами на клетках при добавлении TCGF в культуру.

Итак, приступим. Первым этапом данного эксперимента является извлечение селезенки крысы сразу после эвтаназии. Именно это я сейчас и сделаю, используя стерильные инструменты.

После извлечения селезёнок я помещу их в PBS с добавлением антибиотиков; в качестве антибиотиков я использую пенициллин и стрептомицин. Итак, приступим. Сначала я опрыскиваю крысу 70% ethanol, чтобы исключить любое загрязнение моей культуры.

Затем с помощью инструментов я сделаю небольшой разрез кожи в этом месте. После этого я удалю слой мышцы, и здесь появится селезенка. Затем я возьму другой пинцет и аккуратно извлеку селезенку, стараясь не повредить ее.

Я удаляю соединительную ткань следующим образом. Теперь у меня есть селезенка. Разумеется, я очень осторожен, чтобы не повредить остальные органы в брюшной полости, поскольку любое повреждение кишечника приведет к немедленному загрязнению селезенки.

Затем я перенесу селезенку в пробирку с PBS и антибиотиками. Эту пробирку я буду держать на льду. Таким образом, я извлек селезенки трех крыс.

Теперь мы готовы приступить к подготовке суспензии единичных клеток из полученных селезёнок. Перенеся селезёнки в ламинарный шкаф для работы с культурами тканей, я подготовлю суспензию единичных клеток с помощью клеточных фильтров с размером пор 70 мкм. Для приготовления суспензии единичных клеток из селезёнок мне потребуется несколько компонентов.

Мне понадобятся стерильные инструменты: один пинцет и одни ножницы. Также в чашке Петри у меня находится поршень стерильного шприца объемом 1 ml. Я помещу селезенки в PBS с добавлением антибиотиков.

В другую чашку Петри я поместил клеточный фильтр с порами 70 мкм в 10 миллилитров PBS с антибиотиками. Первый шаг заключается в том, чтобы убедиться, что селезенки очищены, так как, как видно здесь, все еще остались небольшие фрагменты соединительной ткани, и я удалю их, поскольку они очень быстро забьют клеточный фильтр. Для этого я просто отрезаю ненужные части и выбрасываю их в крышку чашки Петри.

Теперь, когда селезенки в основном очищены, я буду брать их по одной, помещать в сеточный фильтр для клеток (cell strainer) и измельчать на мелкие кусочки. Затем я смешаю содержимое всех трех селезенок. Следующий этап — получение суспензии из отдельных клеток. Разумеется, чтобы обеспечить полную стерильность, я не касаюсь фильтра руками, а использую поршень стерильного шприца объемом 1 мл, чтобы продавить кусочки селезенки через фильтр.

Как видно по внешнему виду устройства для подготовки клеток, я получаю суспензию одиночных клеток. На первом этапе еще видны небольшие фрагменты селезенки, однако я уже приступаю к сбору суспензии одиночных клеток. Я уже перенес её в пробирку объемом 50 мл, которую я храню на льду.

Затем я снова заполню фильтр для клеток еще 10 мл PBS с антибиотиками. Я беру примерно 10 мл PBS с антибиотиками; точность до миллилитра здесь не критична, так как мы проводим простое промывание. Я вливаю раствор в фильтр для клеток и повторяю ту же процедуру.

Я снова берусь за поршень шприца и немного сильнее продавливаю содержимое через ocid. Разумеется, извлечь всё содержимое не удастся, так как в сепарационном фильтре останутся соединительная ткань и мелкие частички жира, которые мне не удалось удалить. Тем не менее, большая часть селезенки должна пройти через сепарационный фильтр.

Затем я в точности повторяю действия, выполненные ранее. Я собираю суспензию отдельных клеток и добавляю ее в тот же зуб. К этому моменту в клеточном сепараторе почти не осталось материала с сетки, и выходящий PBS стал гораздо прозрачнее. Я просто промою образец еще раз, и к этому времени большая часть клеток должна быть извлечена.

Теперь, когда у меня есть суспензия отдельных клеток PLE-цитов, я центрифугирую их, чтобы получить осадок. Для этого будет достаточно центрифугирования в течение 8–10 минут. Теперь мы центрифугировали PLE-циты, и у нас получился хороший осадок.

Теперь я удалю супернатант, после чего проведу лизис эритроцитов. Я суспендирую миоциты в растворе хлорида аммония. Я использую 0,15 M раствор хлорида аммония из расчета 5 мл на одну селезенку.

Так как у меня три селезенки, я использую 15 milliliters хлорида аммония, причем выполнять процедуру буду на льду. Чтобы лизировать эритроциты, я буду осторожно пипетировать раствор в течение трех минут. Хорошо, теперь воспользуемся этим ракурсом с более высокой экспозицией.

Таким образом, я анализировал электроциты в течение трех минут. Теперь я заполню пробирку PBS или же можно использовать среду. Это необходимо для того, чтобы вернуть осмолярность раствора к нормальному для клеток диапазону.

Затем я центрифугирую клетки, как и ранее, в течение 8–10 минут для получения осадка. После этого я дважды промою их тем же раствором PBS с антибиотиками. Теперь мы центрифугируем клетки после лизиса электроцитов; не беспокойтесь, стопроцентного выхода электроцитов никогда не бывает.

Таким образом, осадок останется красным, но супернатант станет более прозрачным. Теперь я слью супернатант, ресуспендирую осадок, добавлю PBS до объема 50 мл, центрифугирую и повторю этот шаг еще раз, чтобы промыть клетки дважды. После этого я смогу провести подсчет. Я дважды промыл миоциты, затем суспендировал их в культуральной среде и подсчитал с помощью цитометра.

Как и ожидалось. Из трех селезёнок я получил около 600 миллионов клеток, что закономерно, так как одна селезёнка обычно дает от 200 до 250 миллионов клеток. Теперь я собираюсь посеять клетки в концентрации 2 миллиона на мл в среде, дополненной 10% fetal calf serum.

Затем в эту среду я добавлю 2 µg/mL концентрата А для стимуляции клеток. После этого я просто помещу клетки в инкубатор на 48 часов. Клетки находились в инкубаторе в течение 48 часов и, как я вам покажу, они довольно хорошо разрослись.

Среда окрасилась в оранжевый цвет. Таким образом, мы готовы завершить подготовку для TCGF. Как вы помните, я добавил con carnaval в мою суспензию клеток для их активации.

Таким образом, конканавалин А представляет собой лектин. Он связывается с сахарами на всех рецепторах T-клеток и вызывает искусственную активацию всех этих клеток. Проблема, с которой мы сейчас сталкиваемся, заключается в том, что часть конканавалина А все еще остается в супернатанте клеток.

Поскольку мы собираемся использовать конканалин А в других культурах Т-клеток для экспансии клеток, мы не хотим, чтобы конканалин А присутствовал в этих культурах. Чтобы избавиться от него, я добавлю избыток сахара, с которым связывается конканалин А, а именно метил-α-D-маннозид, показанный здесь. Я добавлю избыток этого сахара и полностью растворю его.

Это свяжет весь оставшийся конканавал-А. После этого я подвергну супернатанты культур клеток стерильной фильтрации и заморожу аликвоты для использования в течение следующих нескольких недель или месяцев. Перейдем к этому заключительному этапу. Я переношу супернатанты культур клеток в пробирки объемом 50 мл, чтобы центрифугировать их для удаления клеток.

Таким образом, я просто заполняю необходимое количество пробирок; я делаю это не в ламинарном шкафу — я мог бы, но поскольку в итоге мне всё равно потребуется отфильтровать раствор, так как я добавляю сахар, который не стерилен, я просто делаю это на лабораторном столе. Так проще. Теперь я перелил все клетки и супернатант в пробирки Falcon объемом 50 мл.

Теперь я помещу их в центрифугу и буду центрифугировать около 10 минут. Центрифугирование необходимо для осаждения клеток, чтобы получить чистый супернатант. Клетки осаждены, супернатант стал прозрачным, и теперь я могу его собрать.

Теперь я соберу весь супернатант в чистую колбу объемом 150 см³. В эту колбу я добавлю сахар. Пока клетки осаждались при центрифугировании, я отвесил количество сахара, необходимое для достижения концентрации 15 mg/ml в супернатанте.

Я дам ему полностью раствориться, после чего профильтру的に стерилизую супернатант. Теперь я добавлю сахар в концентрации 15 mg/ml на объем супернатанта. Я закрою крышку, и так как я работаю не в стерильных условиях, не имеет значения, если часть раствора попадет на крышку; я буду перемешивать до полного растворения сахара.

Это должно произойти довольно быстро. Да, весь сахар теперь растворился. Теперь мне остается только стерильно отфильтровать супернатант, а затем разделить его на аликвоты.

Обычно я готовлю аликвоты по 10–15 мл и храню их при температуре -20 °C. Такие аликвоты могут храниться в течение нескольких месяцев. TCGF также можно хранить в холодильнике, но в этом случае я рекомендую использовать его в течение следующих 10–15 дней.

За последние два дня я показал вам, как готовить фактор роста T-клеток; этот супернатант очень просто и дешево приготовить. Поэтому мы часто используем его в лаборатории для поддержания наших линий T-клеток в культуре, чтобы не покупать дорогостоящие коктейли цитокинов. Желаю удачи в ваших экспериментах.