Affinity очистки вируса гриппа рибонуклеопротеидных комплексов с хроматина инфицированных клеток

Вирусы с одноцепочечной РНК отрицательной полярности. Геном вирусов гриппа упакован в виде вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов (VRNP), в которых одноцепочечный геном инкапсулирован нуклеопротеином и связан с полимеразным комплексом, состоящим из субъединиц PA, PB1 и PB2. Для очистки интактных комплексов из инфицированных клеток млекопитающих клетки HeLa инкубируют с рекомбинантным вирусом гриппа с Strept-тегом.

После проникновения вируса в клетки и синтеза вирусной РНК в ядрах в результате инфекции, клетки лизируют с использованием детергента и разделяют на цитоплазматическую, ядерную и хроматиновую фракции методом центрифугирования и протоколом фракционирования хроматина на основе осаждения. В завершение VRP с стрепт-тегом очищают методом аффинной очистки из каждой фракции. Анализ белкового и РНК-состава очищенных VNP с помощью окрашивания серебром показывает, что при использовании данного протокола можно выделить даже те VRP, которые прочно связаны с хроматином, в интактном состоянии. Таким образом, одним из основных преимуществ нашего протокола по сравнению со стандартными методами аффинной очистки рибонуклеопротеиновых комплексов вируса гриппа является возможность очистки VNP из хроматина инфицированных клеток, который, как известно, является местом синтеза мРНК вируса гриппа.

Таким образом, наш метод может быть использован для поиска ответов на вопросы, касающиеся регуляции вирусной репликации и транскрипции; например, какие вирусные или клеточные факторы, а также какие посттрансляционные модификации необходимы для синтеза вирусной мРНК или синтеза вирусной геномной РНК. Исследователи, которые только начинают использовать этот метод, могут столкнуться с определенными трудностями, так как субнуклеарное фракционирование очень чувствительно к биохимическим условиям и может существенно варьироваться в зависимости от клеточных линий. Начните выполнение данного протокола с использованием наших клеток, инфицированных вирусом гриппа RWSN PB2-strep, в котором Strep-метка генетически слита с C-концом субъединицы PB2, при множественности заражения, равной 3.

Однократно промойте клетки холодным PBS, затем добавьте 12 мл холодного PBS и снимите их с чашки, используя резиновый скребок. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и осадите их путем центрифугирования.

Самым сложным этапом данной процедуры является протокол фракционирования клеток. Ядра клеток очень чувствительны к гомогенизации и процедурам перемешивания, и при неправильном выполнении этих действий можно легко испортить экстракт хроматина. Поэтому крайне важно соблюдать не только технику гомогенизации, но и общие правила обращения с лизатами, которые мы здесь демонстрируем.

После центрифугирования аспирата, PBS и раствора для ресуспендирования (Resus), суспендируйте осадок клеток в 10 миллилитрах холодного сахарозного буфера. Прикрепите наконечник пипетки объемом 200 мкл к пластиковой серологической пипетке объемом 10 мл и пропустите через нее клетки, чтобы разрушить клеточные агрегаты. Инкубируйте суспензию на льду в течение 10 минут.

Периодически осторожно переворачивайте пробирки с клетками для их ресуспендирования. Затем добавьте non IET P 40 до конечной концентрации 0.5% и перемешайте на вортексе на высокой скорости в течение 15 секунд, после чего немедленно центрифугируйте в течение 10 минут при 3,500 ×g и температуре 4 °C в настольной центрифуге. После центрифугирования удалите супернатант и перенесите его в коническую пробирку объемом 15 мл.

Храните супернатант при температуре four degrees Celsius. Это цитоплазматическая фракция. Осадок должен быть меньше по размеру и белее, чем исходный клеточный осадок, как показано здесь.

Если протокол будет завершен позднее, храните осадок клеток при температуре четыре градуса Цельсия. В противном случае продолжите, промыв осадок в пяти миллилитрах холодного сахарозного буфера и центрифугируя, как указано ранее. После завершения центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок, содержащий ядра, в 1,5 миллилитрах холодного буфера для экстракции ядерного плазмотизма.

Перенесите ресуспендированный осадок в охлажденный стеклянный гомогенизатор объемом 4 мл с плотно прилегающим пестиком и гомогенизируйте ядра, совершив 20 движений. Избегайте образования пены; примерно после 10 движений должно наблюдаться увеличение сопротивления. Для подтверждения эффективности гомогенизации исследуйте образец под фазово-контрастным микроскопом.

Ядра больше не должны быть круглыми; они должны приобрести неправильную форму и выглядеть так, будто они лопнули. После гомогенизации ядер перенесите их в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 milliliter. Инкубируйте гомогенат на ротаторе при температуре четыре градуса Celsius в течение 20 минут.

Затем центрифугируйте образец в микроцентрифуге при 16,000 ×g в течение 10 минут при 4 °C. После центрифугирования перенесите супернатант, представляющий собой ядерно-плазматическую фракцию, в пробирку объемом 1.5 мл и храните при 4 °C. Затем ресуспендируйте осадок в 1.5 мл буфера для дигестии, предварительно нагретого до 37 °C.

Затем инкубируйте фракцию в течение 10 минут при 37 °C. Далее добавьте 42 µL 5 M хлорида натрия, чтобы довести конечную концентрация хлорида натрия до 150 мM, затем инкубируйте в течение 20 минут на льду. Центрифугируйте при 16 000 ×g в микроцентрифуге при 4 °C в течение 10 минут.

После центрифугирования снимите супернатант и храните его при температуре 4 °C. Это фракция CH one 50. Ресуспендируйте осадок в 1,5 мл холодного высокосолевого буфера и инкубируйте в течение 20 минут на льду.

Центрифугируйте в микроцентрифуге при 16,000 ×g и температуре 4 °C в течение 10 минут. После центрифугирования удалите супернатант и храните его при температуре 4 °C. Это фракция CH 500.

Достаньте фракции, сохраненные в ходе протокола фракционирования, и поместите их на лед. Затем к цитоплазматической фракции добавьте 300 µL 5 M хлорида натрия. После этого перенесите 100 µL упакованного strep T в гранулах Sphero из каждой фракции в коническую пробирку объемом 15 мл.

Добавьте к гранулам 10 объемов промывочного буфера для стрептавидина. Переверните пробирку для перемешивания и центрифугируйте в течение пяти минут при 1000 ×g в настольной центрифуге, затем удалите супернатант.

Повторите промывку буфером дважды, затем ресуспендируйте осадок в равном объеме буфера для промывки strep, добавьте 200 µL суспензии промытых стреп-агаровых бусин в каждую фракцию. Инкубируйте пробирки в ротаторе в течение одного часа при 4 °C. Затем центрифугируйте пробирки в течение одной минуты при 1000 ×g и 4 °C, после чего удалите супернатант.

Затем добавьте 1 мл промывочного буфера к гранулам, инкубированным с цитоплазматической фракцией в пробирке объемом 15 мл. Добавьте промывочный буфер и перенесите гранулы в пробирку объемом 1,5 мл. Промывайте гранулы в течение одной минуты, затем центрифугируйте пробирки в течение одной минуты при 1000 ×g при температуре 4 °C.

Повторите процедуру дважды после последнего этапа промывки. Удалите все следы промывочного буфера с помощью плоского наконечника пипетки. Затем добавьте 100 µL элюирующего буфера, осторожно перемешайте и поместите пробирки на лед на 15 минут.

Во время инкубации периодически перемешивайте гранулы, аккуратно постукивая по дну пробирок. По истечении 15 минут центрифугируйте смесь в течение одной минуты при 1000 ×g и температуре 4 °C. Соберите супернатант, содержащий элюированные VRP с strep-тегом.

Наши клетки были заражены вирусом гриппа штамма WSN в течение девяти часов, и фракционированные лизаты были проанализированы методом вестерн-блоттинга, как показано здесь. Мягкая изоляция ядер позволяет эффективно экстрагировать цитоплазматические белки, такие как тубулин, избегая при этом высвобождения большого количества ядерных белков. Обратите внимание, что фракция хроматина, экстрагированная в условиях низкой ионной силы, обогащена белками, важными для транскрипции.

В то время как фракция с высоким содержанием соли содержит преимущественно нуклеосомы, для определения белкового состава элюированной цитоплазматической фракции vRNP из клеток R, зараженных в течение девяти часов немаркированным вирусом, RWSN или RWSN PB2-strep, были проанализированы методом окрашивания серебром, как показано для цитоплазматического элюата. Здесь наблюдается высокое соотношение NP к PA, PB1, PB2, о чем свидетельствует основная полоса выше 55 kilodaltons по сравнению с полосами между 95 и 100 kilodaltons, что предполагает, что большая часть strep-PB2 очищается как часть полностью сформированного vRNP, или, иными словами, захватывается мало растворимой полимеразы для сравнения относительных выходов. vRNP, очищенные после девяти часов инфицирования RWSN PB2-strep или RWSN, окрашены серебром, как показано на этом геле с серебряным окрашиванием; vRNP могут быть очищены из всех четырех клеточных фракций через девять часов после инфицирования.

Наивысшая концентрация вРНП обнаруживается в ядерной плазме, хотя значительные количества могут быть также очищены из цитоплазмы и хроматина. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как очищать интактные рибонуклеопротеиновые комплексы вируса гриппа в высоких выходах из ядер инфицированных клеток. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования чистых буферов и избегать неоправданного воздействия комнатной температуры на образцы, чтобы предотвратить деградацию РНК и белков, а также избежать диссоциации белковых комплексов.

И не забывайте, что работа с инфекционным вирусом гриппа может быть опасной. Все этапы следует проводить в боксе биологической безопасности второго уровня до момента добавления NP 40 в лизаты.