Коллекция протокол для поджелудочной железы человека

Общая цель данной процедуры заключается в препарировании поджелудочной железы человека таким образом, чтобы сохранить ее анатомическую ориентацию. Для этого из поджелудочной железы удаляют двенадцатиперстную кишку и селезенку, затем очищают орган от избыточного жира и сосудов. На втором этапе переднюю поверхность окрашивают синими чернилами, а заднюю — черными.

Затем поджелудочную железу разделяют на три области. Каждую область нарезают поперек на равные пластинки и помещают в парафиновые кассеты, формы для OCT или измельчают еще сильнее и помещают в пробирки. В итоге образцы собирают из всех трех областей поджелудочной железы, сохраняя при этом правильную анатомическую ориентацию для последующего анализа.

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов исследований сахарного диабета 1 типа, таких как механизмы, лежащие в основе потери массы или функции бета-клеток, а также характер атаки иммунных клеток. Визуальная демонстрация метода обработки поджелудочной железы имеет решающее значение, поскольку сохранение ориентации поджелудочной железы in vivo требует пристального внимания к деталям. Процедуру продемонстрируют Линда Снайдер, гистотехнолог, и Эмили Монтгомери, биолог из моей лаборатории.

Начните с подготовки всех материалов, необходимых для процедуры. Сначала промаркируйте кассеты для парафиновых блоков, указав идентификатор донора, тип образца, номер аликвоты и любую дополнительную информацию. Затем аналогичным образом промаркируйте формы для OCT.

Отрежьте достаточное количество кусочков алюминиевой фольги, чтобы обернуть каждый блок OCT, и отложите их для последующего использования. Подготовьте все пробирки, необходимые для хранения свежих и замороженных образцов. При необходимости добавьте RNAlater и среду RPMI.

Затем подготовьте рабочие зоны: разместите препаровальные доски, стерилизованные инструменты и все остальные принадлежности, необходимые для процедуры, как в боксе биологической безопасности, так и на столешнице. Расположите все кассеты и формы для OCT в порядке их использования поблизости. Приготовьте охлаждающую баню, добавив достаточное количество изопентана, чтобы полностью покрыть сухой лед на дне пенопластового контейнера.

Для начала диссекции удалите двенадцатиперстную кишку и селезенку. Начните отделять двенадцатиперстную кишку от поджелудочной железы с одного конца и продолжайте до полного отсоединения. Селезенка прикреплена слабо и легко удаляется из жировой ткани и от поджелудочной железы.

Затем очистите поджелудочную железу от постороннего жира, сосудов и нервов, используя сочетание тупой и острой диссекции. Отложите жир и лимфатические узлы для последующей обработки. После очистки поместите поджелудочную железу на препаровальную доску, застеленную бумажными полотенцами.

Поддержание правильной ориентации поджелудочной железы является самым сложным аспектом данной процедуры. Для обеспечения успеха переднюю и заднюю поверхности окрашивают чернилами разных цветов. Окуните аппликатор с ватным наконечником в синие чернила, нанесите их на переднюю поверхность поджелудочной железы и промокните излишки.

Затем окуните новый аппликатор в черные чернила и нанесите их на заднюю поверхность поджелудочной железы. Верните поджелудочную железу в исходное положение. Теперь, когда передняя поверхность обращена вверх, поджелудочная железа готова к разрезанию на три секции.

Сначала сделайте разрез в месте соединения головки и тела. Затем разделите оставшуюся часть на примерно равные сегменты, чтобы отделить тело от хвоста, и зафиксируйте вес каждой области поджелудочной железы, начиная с головки.

Разделите каждую область на секции толщиной примерно 0.5 сантиметра, выполняя поперечные разрезы, аналогично нарезке буханки хлеба. После того как каждая область поджелудочной железы будет нарезана, извлеките последний срез области головки — участок соединения головки и тела — и поместите его на отдельный препаратный столик. Измельчите этот участок на мелкие кусочки и равномерно распределите их по маркированным криопробиркам с добавлением RNA и без неё.

Затем пробирки замораживают, следуя стандартным процедурам. Повторите эту процедуру для секции соединения тела и хвоста.

После сбора измельченных образцов наклоните все поперечные срезы вправо. Будут удалены чередующиеся срезы каждой области. Для блоков в парафине и ОСТ удалите первый срез для парафинирования.

Если срез слишком велик, разрежьте его пополам. Промаркируйте кассеты как A и B. Если фрагмент все еще слишком велик, разрежьте каждую часть перпендикулярно предыдущему разрезу, а затем промаркируйте кассеты от A до D по часовой стрелке. Как показано здесь, расположите кассету так, чтобы метка находилась слева.

Затем поместите ткань в кассету и закройте крышку. Перенесите кассету в контейнер с нейтральным буферным формалином. Пронумеруйте блоки последовательно внутри каждой области, начиная с самого медиального среза для блоков OCT.

Налейте тонкий слой среды OCT в предварительно маркированную форму. Перед помещением ткани покройте её средой OCT и быстро заморозьте образец для последующего использования, вернувшись к ткани, отложенной ранее. Выделите лимфатические узлы поджелудочной железы, удалив жир и соединительную ткань, окружающие капсулу узла. Поместите узлы в стерильный лоток с DMEF и измельчите крупные узлы на фрагменты размером не более 0.5 сантиметров.

После выделения панкреатических лимфатических узлов распределите ткань между подготовленными пробирками и кассетами для дальнейшей обработки. После завершения работы с лимфатическими узлами селезенку измельчают и хранят аналогичным образом. Для обработки двенадцатиперстной кишки используйте увлажненную марлевую салфетку, чтобы очистить слизистую оболочку от слизи, затем вырежьте слизистую и разрежьте ее на фрагменты.

Разделите образцы слизистой оболочки, как показано ранее. С помощью этой процедуры собирают репрезентативные образцы из каждого отдела поджелудочной железы, как показано здесь. Вес образцов из головки, тела и хвоста был примерно одинаковым.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как обрабатывать поджелудочную железу человека для получения различных типов образцов, в частности, о том, как сохранять их ориентацию, а также о том, как изолировать лимфатические узлы из перипанкреатической жировой клетчатки.