Измерительная ячейка Кинетика цикла прогрессии с метаболическим Маркировка и проточной цитометрии

Общая цель следующей процедуры заключается в измерении кинетики и прогрессии клеточного цикла. Сначала клетки подвергаются импульсному мечению с использованием ромо-, дезокси-уридина или BRDU, которые встраиваются в ДНК клетки вместо тимидина. Затем клетки подвергаются иммуноокрашиванию антителами к BRDU и анализируются методом проточной цитометрии сразу после окрашивания.

Метятся только клетки в S-фазе, при этом меченые клетки проходят клеточный цикл до фазы G2. После митоза они определяются как клетки с содержанием ДНК 4N. Содержание ДНК снижается до 2N. Таким образом, анализ профилей флуоресценции, полученных методом проточной цитометрии, может быть использован для определения кинетики прохождения клеточного цикла.

Основное преимущество данной методики по сравнению с другими протоколами, в которых для синхронизации клеток используются химические вещества, заключается в отсутствии физиологических нарушений, которые могли бы непреднамеренно повлиять на механизмы клеточного деления. Мы впервые применили этот метод, когда наши попытки изучить скорость прохождения клеточного цикла с помощью химической синхронизации привели к неожиданным результатам, которые помешали проведению анализа. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области клеточной биологии.

Например, в чем заключается основа различий в скорости роста разных типов клеток? Чтобы выяснить это, начните выполнение данного протокола с импульсного мечения клеток BrdU. Для начала подготовьте по одной 10-сантиметровой чашке для каждой временной точки, а также по одной чашке для каждого из следующих контролей.

Только BrdU; только PI; BrdU-отрицательные; PI-отрицательные. Высейте в каждую лунку 5 × 10⁵ клеток MCF-7 в дополненную среду DMEM. Инкубируйте планшеты от 24 до 48 часов, чтобы клетки восстановились и прикрепились. После достижения клетками 60% конфлюэнтности замените среду на свежую DMEM, содержащую 10 µM.

Инкубируйте клетки с BrdU в течение одного часа при 37 °C и 5% CO2 для обеспечения включения BrdU в ДНК. Обязательно оставьте одну планшетку необработанной в качестве отрицательного контроля или нулевой временной точки через один час. Удалите среду для импульсного мечения и коротко промойте клетки PBS перед переходом к временным точкам от двух до восьми часов.

Добавьте свежую ростовую среду и поместите планшеты обратно в инкубатор. Затем немедленно соберите образцы с планшетов для временных точек 0 и 1 час, как описано в следующем разделе. Чтобы собрать клетки, аспирируйте среду и промойте планшет.

Сначала промойте клетки PBS, затем добавьте трипсин, чтобы открепить их от планшета, и соберите их в DMEM; центрифугируйте при 390 ×g в течение пяти минут. Удалите супернатант. Затем промойте клетки 1–5 мл ледяного PBS, центрифугируйте при 390 ×g в течение пяти минут; после центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 100 µL ледяного раствора.

Холодный PBS, содержащий 1% FBS. FBS помогает предотвратить агрегацию клеток. Одним из наиболее важных аспектов данной процедуры является получение суспензии единичных клеток из собранного материала.

Для фиксации. Чтобы добиться этого, вы можете добавлять клетки в этанол по каплям. Это критически важно. Далее, для фиксации клеток, с помощью пипетки по каплям добавьте клетки в 5 mL ледяного раствора.

70% этанол в конической пробирке объемом 15 мл. Инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут или храните их при температуре 4 °C в течение ночи. Это оптимальный этап для остановки сбора образцов из разных временных точек; образцы могут находиться в этаноле в течение нескольких дней, что позволяет одновременно обрабатывать их на последующих этапах протокола для окрашивания BrdU и пропидиййодидом.

Извлеките клетки из температуры 4 °C и центрифугируйте их при 90 ×g трижды по пять минут. После центрифугирования аспирируйте большую часть фиксатора, оставив около 50 µL. Затем перемешайте на вортексе.

Для разрыхления осадка и денатурации ДНК при перемешивании в вортексе медленно и по каплям добавьте 1 mL 2N HCl Triton X 100, затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 30 минут. Осадите клетки, центрифугируя образцы в течение 5 минут при 390 ×g, после чего аспирируйте и удалите супернатант.

Затем ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл 0,1 М тетрабората натрия. После центрифугирования снова аспирируйте клетки и удалите супернатант. Затем ресуспендируйте осадок клеток в 75 µL красителя BrdU.

Перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут, защищая от света после завершения инкубации. Осадите клетки путем центрифугирования, как описано ранее, и ресуспендируйте клеточный осадок в одном миллилитре PBS, содержащем пять микрограмм на миллилитр пропидийиодида. При анализе образца, положительного по PI, на проточном цитометре, постройте график прямого светорассеяния (forward scatter) в зависимости от бокового светорассеяния (side scatter), чтобы убедиться в правильном распределении клеток по размеру.

Оба этих параметра следует отображать в линейном масштабе. Одновременно просмотрите график зависимости FL three H от FL two W, чтобы сопоставить окрашивание PI с шириной флуоресцентного импульса. Этот график используется для создания гейта с целью выделения фракции клеток, которые, по мнению исследователя, находятся в пределах нормального распределения фаз клеточного цикла.

В целом, такая картина распределения характеризуется двумя кластерами клеток с содержанием ДНК, равным 2N и 4N при окрашивании PI, что соответствует фазам G1 и G2 клеточного цикла соответственно. Группа клеток, расположенная между этими двумя кластерами, представляет собой клетки в процессе репликации ДНК, которая происходит в S-фазе клеточного цикла. Постройте график с отображением гейтированных клеток, где по оси Y в логарифмическом масштабе отложен параметр FL1-H или FITC, а по оси X в линейном масштабе — PI.

Этот график будет использоваться для настройки оставшихся параметров с помощью различных элементов управления, а также для сбора данных. Для анализа поместите образец, окрашенный только PI, в загрузочный порт проточного цитометра и отрегулируйте усиление так, чтобы G1 находился примерно на отметке 200 по оси x. Это будет проще визуализировать на гистограмме окрашивания PI.

Затем поместите образец, содержащий только BRDU, в загрузочный порт и запустите анализ. Отрегулируйте усиление таким образом, чтобы на графике отобразились две популяции клеток: BRDU-положительные и BRDU-отрицательные. В идеале BRDU-отрицательные клетки должны располагаться на уровне или чуть ниже 10¹.

Заключительным контролем является отрицательный образец BrdU/PI. Прогоните этот отрицательный контроль, чтобы убедиться, что клетки не появляются ни в одном из верхних или правых квадрантов. После настройки параметров различных графиков проточный цитометр считается откалиброванным и готовым к анализу клеток, окрашенных BrdU и PI. Для каждого образца соберите данные минимум по 10 000 клеток, отобранных по гейту PI.

Затем с помощью такого программного обеспечения, как FlowJo или FACSDiva, постройте график зависимости FITC от PI, выделив гейтом PI-положительные клетки на основе графика зависимости PI от FL2. Это позволит выделить циклирующую популяцию. Далее создайте второй гейт для изоляции BrdU-положительной популяции.

Затем для отслеживания временного хода прогрессии клеточного цикла постройте график зависимости количества BrdU-положительных клеток с содержанием ДНК, соответствующим фазам G1 или G2, от времени, чтобы сравнить кинетику прогрессии клеточного цикла между двумя линиями колоректального рака HT 29 и LS 180. Сбор клеток проводили каждый час в течение восьми часов после прекращения импульсного воздействия BrdU.

При сравнении кинетики двух профилей становится очевидным появление пика G1 через t = 4 часа после введения BrdU в клетках LS 180 по сравнению с соответствующей временной точкой для клеточной линии HT 29, в которой этот пик отсутствует. Это указывает на ускоренное прохождение клеточного цикла через фазу G2. В колоректальной клеточной линии LS 180 для создания профиля цикла клеточной линии рака молочной железы.

Клетки MC seven собирали каждый час в течение восьми часов после завершения импульса BrdU. Затем иммуномеченные клетки, подвергнутые контр-окрашиванию ДНК, сортировали на основании их флуоресцентных сигналов.

Как видно здесь, клетки CF seven делились значительно медленнее, чем любая из двух протестированных линий клеток колоректального рака. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как метаболическое мечение ДНК в сочетании со сбором образцов в определенные моменты времени позволяет отслеживать кинетику клеточного цикла.