Окрашивание протоколы по правам островков поджелудочной железы
23 мая 2012 г.
Это видео демонстрирует процедур для характеристики человека панкреатических островков использованием гематоксилином и эозином (H & E) и иммуногистохимии (IHC). Поджелудочной разделы с головы, тела и хвоста регионов окрашиваются как H & E и IHC, чтобы определить островок состав эндокринной (инсулин, глюкагон и панкреатический полипептид), ячейка репликации (Ki67), воспалительные инфильтраты (H & E, CD3). Крючковатыми области локализован использованием IHC для панкреатический полипептид.
Общая цель данной процедуры — характеристика островков Лангерганса поджелудочной железы человека с помощью окрашивания гематоксилином и эозином, а также иммуногистохимического анализа. Это достигается путем создания серийных срезов образца поджелудочной железы, залитого в парафиновый блок. Затем срезы наносятся на предметные стекла с сохранением их первоначальной ориентации.
Часть стекол окрашивают гематилином и эозином, а остальные — методом иммуногистохимии; заключительный этап заключается в сканировании окрашенных стекол и их систематизации по клиническим случаям. В конечном итоге эти изображения могут быть загружены в онлайн-базу данных патологоанатомических исследований, где они будут доступны другим исследователям в этой области. Главным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами является то, что окрашивание стекол проводится серийно с сохранением их первоначальной ориентации.
Процедуру продемонстрируют Линда Снайдер, гистотехнолог, Эмили Монтгомери, биолог, и Тиффани Хиппо, лабораторный техник моей лаборатории. Для начала подготовьте водяную баню и микротом в соответствии со стандартными процедурами парафиновой микротомии. Затем подпишите положительно заряженные предметные стекла, указав номер случая, область поджелудочной железы и номер стекла.
После завершения всех подготовительных действий поместите парафиновый блок в зажим микротома так, чтобы этикетка кассеты находилась с левой стороны. Следуя стандартным процедурам микротомии, производите срезы блока до равномерного обнажения ткани. Как только ткань будет полностью открыта, сделайте ленту серийных срезов толщиной около четырех микрон.
В зависимости от количества необходимых начальных окрашиваний потребуется от трех до шести срезов. Затем разделите срезы ленты. Последовательно берите каждый срез и помещайте его на предметное стекло.
Запишите номер среза карандашом. Если срез непригоден для использования, пропустите этот номер и продолжайте нумерацию срезов в строгом порядке. Следите за тем, чтобы ориентация среза на стекле совпадала с ориентацией в кассете, при этом метка стекла должна быть направлена влево.
Затем поместите предметные стекла в штатив и оставьте их сохнуть на ночь. При комнатной температуре запечатайте поверхность парафинового блока тонким слоем парафина для сохранности ткани и поместите его на хранение при комнатной температуре или при минус 20 градусов Цельсия. Повторите данную процедуру для следующего образца.
Важно соблюдать нумерацию серийных срезов на каждом уровне, как показано выше для окрашивания гематоксилином и эозином. Поместите первый предметный стеклец из каждого блока в кассету для стекол, а затем установите кассету в первый лоток автоматического окрашивателя. Выберите стандартную программу HE и запустите процесс окрашивания.
По завершении окрашивания извлеките предметные стекла из автоокрашивателя и поместите их в вытяжной шкаф для накрывания покровными стеклами. На каждое предметное стекло нанесите покровное стекло, используя стандартные методы. В завершение подпишите стекла с помощью печатных этикеток и дайте им полностью высохнуть в вытяжном шкафу.
Начните с настройки автоматического окрашивателя и подготовки всех необходимых реагентов. Для двойного окрашивания выберите программу Daco. Введите количество предметных стекол и тип обработки для каждого из них.
Загрузите все реагенты в автоматический окрашиватель в соответствии с рекомендациями производителя. Затем приготовьте буферы TBST и цитратный буфер, антитела и другие реагенты, необходимые для процедуры. Депарафинизируйте стекла, поместив их в ксилол на пять минут.
Не допускайте высыхания предметных стекол, так как это приведет к избыточному окрашиванию фона и пор во время депарафинизации. Налейте цитратный буфер в автоклав-стерилизатор (стимер) для предварительного нагрева перед использованием. Затем подвергните депарафинизированные стекла серии промывок этанолом.
Промойте предметные стекла в деионизированной воде в последний раз. Поместите стекла в предварительно нагретый цитратный буфер и выдержите их при кипении в течение 30 минут. По истечении этого времени немедленно перенесите стекла в водяную баню при комнатной температуре до их полного охлаждения.
После охлаждения перенесите предметные стекла в кассеты автоокрашивателя Dayco, соблюдая правильную последовательность. В завершение запустите программу двойного окрашивания, загруженную ранее. По окончании программы двойного окрашивания извлеките предметные стекла из автоокрашивателя и оставьте их высыхать минимум на один час перед дегидратацией.
Для продолжения дегидратации перенесите их в 80% ethanol на одну минуту. Продолжите дегидратацию предметных стекол, выдерживая их в 95% ethanol, а затем в 100% ethanol. В завершение погрузите предметные стекла в xylene и выдержите одну минуту.
Для завершения процедуры немедленно закройте стекла покровными стеклами, используя CytoSeal. Распечатайте этикетки с информацией о случае, включая орган, номер блока, тип окрашивания и дату. Наклейте этикетку на каждое стекло для последующего сканирования окрашенных препаратов.
Поместите их на лоток сканера и следуйте стандартным процедурам. Архивируйте окрашенные препараты при комнатной температуре, а все оставшиеся неокрашенные препараты — при минус 20 градусов Цельсия для последующего использования. Наконец, систематизируйте полученные изображения окрашенных срезов по донору и типу ткани.
Ниже приведен пример окрашивания на KI 67 и инсулин при малом и большом увеличении. Изображения окрашенных срезов поджелудочной железы вносятся в онлайн-базу данных патоморфологии, создавая виртуальный биобанк. Используя эту базу данных, исследователи могут быстро получать информацию, необходимую для изучения сахарного диабета 1-го типа.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как готовить и окрашивать высококачественные гистологические препараты поджелудочной железы человека.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируются процедуры характеристики островков поджелудочной железы человека с использованием окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и иммуногистохимии (ИГХ). Этот метод позволяет оценить эндокринный состав островков, репликацию клеток и воспалительные инфильтраты.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Эндокринология
- Гистология
Теоретические сведения
- Островки Панкреаса человека играют важнейшую роль в метаболизме глюкозы.
- Характеристика состава островков имеет принципиальное значение для понимания механизмов диабета.
- Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и иммуногистохимия (IHC) являются стандартными методами анализа тканей.
- Сохранение исходной ориентации предметных стекол критически важно для точной оценки.
Цель исследования
- Для характеристики островков панкреаса человека.
- Для определения эндокринного состава островков.
- Для оценки репликации клеток и воспалительных реакций.
Используемые методы
- Изготовление серийных срезов образцов поджелудочной железы, залитых парафином.
- Окрашивание срезов гематоксилином и эозином (H&E), а также иммуногистохимическое окрашивание (IHC).
- Сканирование окрашенных предметных стекол для последующего анализа.
- Организация изображений по клиническим случаям для загрузки в базу данных.
Основные результаты
- Идентификация инсулина, глюкагона и панкреатического полипептида в островках.
- Оценка репликации клеток с помощью окрашивания на Ki67.
- Оценка воспалительных инфильтратов с помощью окрашивания Г&Э и на CD3.
- Успешная локализация крючковидного отростка с помощью ИГХ.
Выводы
- Данный метод обеспечивает комплексную характеристику островков поджелудочной железы.
- Сохранение исходной ориентации предметного стекла повышает точность анализа.
- Результаты способствуют пониманию функций поджелудочной железы в норме и при патологиях.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Стандартизированные рабочие процессы гистопатологического анализа островков поджелудочной железы человека обеспечивают воспроизводимую характеристику эндокринных клеток, что способствует валидации мишеней в исследованиях диабета. Благодаря сохранению ориентации серийных срезов и созданию оцифрованных полнослойных изображений, данный метод облегчает кросс-функциональный обмен данными и биобанкинг для снижения рисков при разработке механизмов терапии, направленной на островки. Такой подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, предоставляя количественные данные с пространственным разрешением о составе островков, репликации и иммунных инфильтратах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством строгого гистопатологического анализа и иммунолокализации эндокринных клеток островков.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков путем характеристики морфологии, размера, плотности островков и состава эндокринных клеток с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и иммуногистохимического (ИГХ) анализа.
- Прогностическая ценность: помогает в сортировке портфеля проектов путем оценки репликации островков и апоптотических клеток с помощью Ki67 и других маркеров пролиферации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов исследования путем стандартизированного разделения поджелудочной железы человека на определенные области (головка, тело, хвост) и выполнение поперечных срезов.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа путем нумерации и алфавитного обозначения подсекций в зависимости от их размера для проведения полного анализа поперечных сечений.
- Ценность платформы: Демонстрация готовности к скринингу и масштабируемости за счет оцифрованных изображений целых слайдов, организованных в онлайн-базе данных патоморфологии, доступной более чем 200 исследователям.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Рассматривается значимость для изучения заболеваний путем оценки островков на наличие воспаления, фиброза, амилоида и Т-клеточных инфильтратов с использованием окрашивания H&E и CD3.
- Практическая ценность: Описывается преемственность от этапа открытия до доклинической валидации путем анализа как эндокринного, так и экзокринного отделов, включая патологию протоков и неоплазию.
- Снижение рисков при разработке: Основное внимание уделяется прогностическому снижению рисков путем характеристики внутрипротоковой неоплазии поджелудочной железы и ее связи с системой протоков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых терапевтических мишеней — от их первичной валидации до доклинической оценки — обеспечивая возможность серийного микротомирования, стандартизированного окрашивания и создания цифрового биобанка тканей поджелудочной железы человека.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов с помощью гистопатологии и иммунолокализации островков поджелудочной железы и эндокринных клеток.
- Скрининг: гарантирует готовность и воспроизводимость анализа за счет сохранения исходной ориентации предметного стекла при серийном срезании и последовательном окрашивании.
- Аналитика: позволяет проводить количественные измерения площади и количества островков, состава эндокринных клеток, репликации и Т-клеточных инфильтратов с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) и иммуногистохимии (IHC) для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями путем оценки амилоида островков, фиброза и воспалительных инфильтратов, имеющих значение для патогенеза сахарного диабета 1 типа.
- Корпоративное повторное использование: представляет данный метод как многократно используемую технологию посредством онлайн-базы данных патоморфологии, которая обеспечивает быстрый обмен данными и выбор блоков для парафиновых или замороженных серийных срезов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности в составе эндокринных клеток островков и иммунных взаимодействиях.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость процессов серийного срезания, окрашивания и цифрового архивирования препаратов.
- Стратегическая ценность: Обоснованность решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях за счет раннего выявления патологии островков и статуса репликации.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных показателей морфологии островков, их плотности и фенотипов эндокринных клеток.
Особенности реализации
- Необходимый уровень научной квалификации в области гистотехнологии, иммуногистохимии и рабочих процессов цифровой патологии.
- Потребности в инструментарии и аналитической инфраструктуре, включая микротом, автоматический окрашиватель, сканер слайдов и доступ к онлайн-базе данных патоморфологических исследований.
- Требования по межкомандной стандартизации маркировки слайдов, нумерации срезов и соблюдения ориентации образцов при взаимодействии групп гистологии и визуализации.
- Особенности адаптации для различных модельных систем, в частности при применении стандартизированной региональной обработки (головка, тело, хвост) к поджелудочной железе животных.
- Практические ограничения включают вариабельность тканей доноров органов и необходимость оптимизации валидации антител для мультиплексного ИГХ-окрашивания.
