Выделение CD4 + Т-клеток от мышей лимфатических узлов с помощью Miltenyi MACS очистки

Это магнит Max MIDI. На нем указано: «Осторожно, чрезвычайно сильные магнитные поля». Здравствуйте, я Мелани Мэтью из лаборатории Майка Коллинза факультета физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне.

Сегодня мы продемонстрируем подготовку CD4-положительных Т-клеток методом негативной селекции с использованием наборов Milton Biotechnology. Перед нами системы MiniMAX и MiniMAX, причем MiniMAX используются для разделения больших объемов проб. Через колонку, совместимую с MiniMAX, можно пропустить до 10⁹ клеток, в то время как MiniMAX предназначены для значительно меньшего количества клеток.

Таким образом, в зависимости от того, проводите ли вы положительную или отрицательную сепарацию, вам следует пометить клетки соответствующими антителами. К антителам прикреплены магнитные частицы, которые будут удерживаться магнитом. При отрицательной селекции интересующие вас клетки пройдут сквозь колонку, и вы сможете собрать элюат, содержащий искомые клетки.

Я должен отметить, что методы, которые я демонстрирую вам сегодня, не являются стерильными. Поэтому, если вы планируете использовать эти клетки для клеточного культивирования, все манипуляции следует проводить в ламинарном шкафу для культур тканей с использованием стерильных инструментов. Таким образом, несмотря на то что я показываю вам подготовку CD4-положительных Т-клеток, многие из этих методов применимы для очистки других типов клеток с использованием наборов Miltenyi Biotec.

Итак, я удалил лимфатические узлы у мыши; подробно этот процесс показан в седьмом выпуске JoVE «Подготовка лимфатических узлов для двухфотонной визуализации». Теперь я перетру лимфатические узлы до состояния суспензии из одиночных клеток с помощью клеточного сита с размером пор 70 мкм. Теперь я буду измельчать лимфатические узлы до получения суспензии из одиночных клеток, используя поршень шприца объемом 6 мл.

Лимфатические узлы находятся в среде RPMI внутри фильтра; важно подготовить качественную суспензию из отдельных клеток. Мы используем фильтр для того, чтобы убедиться в отсутствии клеточных агрегатов. По завершении измельчения я извлеку фильтр из среды, после чего использую материал, прошедший через сито, в качестве суспензии из отдельных клеток.

При растирании необходимо убедиться, что ткань максимально разрушена. Именно из этой суспензии одиночных клеток мы будем очищать CD4-положительные Т-клетки. Итак, я закончил растирать ткань, и вы видите, что большая часть лимфатических узлов практически полностью разрушена.

У нас всё ещё остались небольшие фрагменты жировой ткани и своего рода капсулы лимфатических узлов с небольшим количеством соединительной ткани, которые слиплись вместе из всех шести лимфоузлов. Теперь я снимаю клеточный фильтр. Как видите, среда стала очень мутной.

Оно заполнено клетками из суспензии одиночных клеток, чтобы обеспечить получение максимального количества клеток с фильтра, так как часть из них может прилипнуть к нему. Я промываю его несколькими мл среды, затем переношу всю среду пипеткой в 15 мл пробирку Falcon и центрифугирую ее для осаждения клеток для последующей очистки. Итак, перед нами суспензия одиночных клеток, центрифугированная и осажденная при 300 G в течение 10 минут.

Если вы предполагаете, что в вашей суспензии единичных клеток будет высокая доля погибших клеток, рекомендуется использовать набор для удаления мертвых клеток от Miltenyi Biotec. Теперь, когда я получил осадок, я слью среду и проведу лизис эритроцитов, после чего подсчитаю количество клеток и применю набор для отрицательной селекции CD4-положительных Т-клеток для данных конкретных клеток. Итак, теперь я приступлю к лизису эритроцитов.

Мы собираемся провести лизис эритроцитов, которые осадились в грануле вместе с лимфоцитами, путем снижения осмолярности раствора: сначала мы добавим воду, а затем снова доведем концентрацию до 1X, добавив 10X DPBS. Лимфоциты более устойчивы к изменению осмолярности, чем эритроциты, однако нам все равно необходимо работать быстро, чтобы избежать лизиса лимфоцитов, чего следует избегать. Для ускорения процесса я заранее отмеряю объемы реагентов, необходимых для лизиса, до того как начать добавлять воду в систему.

Я хочу добавлять 10X DPBS через несколько секунд после добавления воды, чтобы избежать лизиса лимфоцитов и обеспечить лизис эритроцитов. Для этого я беру 900 µL воды (почти 1 mL) и 100 µL 10X DPBS.

У меня готовы обе пробирки. В лизат я добавляю воду, жду несколько секунд, возможно, немного встряхиваю пробирку, а затем добавляю 10 X-D-B-P-S и еще раз слегка встряхиваю. Если вы лизируете большое количество эритроцитов, вы заметите образование крупного аморфного сгустка из всех разрушенных клеточных мембран.

У нас здесь есть небольшое количество материала, и вы можете видеть, что это фрагменты разрушенных клеточных мембран. После проведения лизиса, на случай возможной ошибки при дозировании пипеткой, я предпочитаю добавить несколько мл среды к клеткам, чтобы обеспечить правильную осмолярность и остановить дальнейший лизис. Итак, теперь у меня есть лимфоциты в виде суспензии из отдельных клеток.

Я снова провел лизис эритроцитов, теперь я центрифугирую клетки для получения осадка. Перед этим я подсчитаю их с помощью гемоцитометра, чтобы определить количество антител, которое потребуется добавить для набора негативной селекции CD4-положительных Т-клеток. Итак, теперь я центрифугирую клетки в буфере MAX; видно, что после лизиса эритроцитов осадок стал гораздо более белым.

Теперь я проведу негативную селекцию CD4-положительных Т-клеток. Для этого я слейю всю среду и буфер Max, в котором осаждали клетки. Затем я проведу маркировку с помощью коктейля антител с биотином, что является первым этапом негативной селекции CD4-положительных Т-клеток.

Затем я инкубирую их в холодильнике в течение 10 минут. Итак, первичная инкубация клеток завершена. Теперь я добавлю микросферы с антибиотиком и снова помещу их в холодильник на 15 минут.

Для данного разделения клеток мы используем колонку LS от Miltenyi Biotec. Мы закрепим ее в магнитном держателе и подготовим, пропустив через нее 3 mL буфера MACS. Мы откроем колонку и установим ее так, чтобы зубцы были направлены внутрь к магниту. Теперь я добавлю буфер MACS в колонку; вы увидите, как он проходит через колонку LS и начинает капать снизу. Не беспокойтесь о том, что колонка может пересохнуть.

Поверхностное натяжение жидкости предотвратит ее высыхание до тех пор, пока вы не добавите клетки. Перед добавлением клеток важно дать буферу MAX полностью пройти через колонку. Итак, после 15-минутной инкубации клеток с магнитными бусинами, конъюгированными с биотином, в буфере MAX, я слью буфер и ресуспендирую клетки в объеме буфера, соответствующем количеству клеток.

Поэтому вам потребуется проверить протокол для mini tiny для этого этапа. Затем я нанесу их на колонку, которую мы только что промыли буфером max. Теперь мы добавим клеточную суспензию в колонку.

Поскольку это колонка для негативной селекции, мы собираем клетки, прошедшие сквозь нее; в данном случае это должны быть CD4-положительные Т-клетки. Теперь я промою колонку 12 мл буфера MAC, снова собирая элюат, который должен содержать только CD4-положительные Т-клетки. После этого я центрифугирую CD4-положительные Т-клетки, ресуспендирую их, а затем маркирую соответствующим красителем, который будет использоваться для визуализации tau-белка.

Я также возьму небольшой образец очищенных клеток, помечу их антителами к CD3 и CD4 и проанализирую с помощью FACS, чтобы убедиться в чистоте популяции CD4-положительных T-клеток. Перед нами клетки, которые мы только что осадили центрифугированием. Это должна быть популяция чистых CD3+, CD4-положительных T-клеток.

Таким образом, я продемонстрировал вам метод отрицательной селекции CD4-положительных T-клеток. Используя набор Miltenyi Biotec, мы проведем адаптивный перенос этих клеток мыши и используем её в одном из наших собственных экспериментов с T-фотонным микроскопом. Желаю успехов в ваших собственных исследованиях.