Количественное измерение Invadopodia-опосредованного протеолиза внеклеточной матрицы в одно-и многоклеточных контексты

Данный стандартный метод позволяет получить покрытые флуоресцентно меченым желатином покровные стекла, которые подходят для количественного анализа деградации матрикса инвазивными подозиями. После покрытия покровных стекол флуоресцентно меченым желатином высейте клетки и культивируйте их для деградации матрикса. Затем зафиксируйте клетки и окрасьте их флуоресцентными маркерами белков инвазивных подозий, получите изображения и количественно определите степень деградации матрикса.

Типичные результаты позволяют количественно оценить различия в деградации матрикса, опосредованной подиями, между клетками с различной манипуляцией выбранными генами или после обработки фармакологическими агентами. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как подготовка покрывных стекол с желатиновым покрытием и однородной флуоресценцией затруднительна из-за неравномерного нанесения флуоресцентного желатина или неправильного обращения с покрывными стеклами с желатиновым покрытием. Процедуру продемонстрируют профессор-исследователь Карен Мартин, постдокторант Мэнди Аммер и аспиранты Элиза Уок, Карен Хейз и Стив Маркуэлл.

Для приготовления немаркированного 5% стокового раствора желатина и сахарозы смешайте желатин и сахарозу в PBS и полностью растворите при 37 °C. Затем храните при 4 °C. Перейдите к очистке стеклянных покровных стекол.

Поместите по одному покровному стеклу в каждую лунку 24-луночного пластикового планшета для культивирования тканей, добавьте в каждую лунку 500 µL 20% азотной кислоты и инкубируйте в течение 30 минут. После удаления раствора азотной кислоты трижды промойте покровные стекла деионизированной водой. Затем переходите к нанесению покрытия.

На каждое покровное стекло нанесите 500 µL полилизина в концентрации 50 µg/mL и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Удалите раствор полилизина и промойте трижды с помощью PBS. Покрытие поли-L-лизином способствует равномерному нанесению и связыванию последующего слоя меченого желатина. Поместите 24-луночные планшеты на лед и добавьте в каждую лунку 500 µL свежеприготовленного 0,5% глутаральдегида.

Инкубируйте планшеты на льду в течение 15 минут. Промойте трижды холодным PBS, затем аспирируйте все остатки PBS перед нанесением желатинового покрытия. Тем временем, во время инкубации с глутаральдегидом, восстановите желатин, конъюгированный с Oregon Green 488.

Согласно протоколу производителя, подогрейте этот раствор и немеченый стоковый раствор 5% желатина с сахарозой до 37 °C. Затем разведите 500 µL меченого желатина в четырех миллилитрах немеченого желатина с сахарозой. Нанесите по 100 µL разведенной смеси желатина с 4 88 на каждое покровное стекло.

Используйте достаточное количество желатина, чтобы покрыть покровное стекло без необходимости распределять его вручную. Важно поддерживать температуру разбавленной смеси желатина 4 88 на уровне 37 °C в процессе нанесения покрытия, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание. Кроме того, начиная с этого этапа, держите покровные стекла в темноте столько, сколько возможно, чтобы избежать потенциального фотовыцветания.

После того как все покровные стекла на одной планшете будут покрыты, держите планшет под наклоном и удалите излишки желатина из каждой лунки с помощью вакуумной аспирации. Затем инкубируйте покрытые покровные стекла в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре. После трехкратной промывки покровных стекол PBS добавьте 500 µL борогидрида натрия.

Борогидрид вызывает вспенивание, поэтому на покровных стеклах и вокруг них будут видны мелкие пузырьки; инкубируйте образцы в течение 15 минут при комнатной температуре для восстановления и инактивации остаточного глутаральдегида. Удалите раствор борогидрида натрия с помощью вакуумного аспиратора быстрыми sweeping-движениями по внешнему краю каждой лунки; будьте осторожны, чтобы не захватить плавающие покровные стекла, которые могли отсоединиться от дна планшета для культивирования тканей во время обработки борогидридом натрия. После трех промывок PBS инкубируйте покровные стекла в 70% ethanol в течение 30 минут при комнатной температуре.

Соблюдая правила стерильности, перенесите покровные стекла с планшетами в ламинарный шкаф II класса для культуры B-клеток и трижды промойте их стерильным PBS, используя стерильную иглу и пинцет. Осторожно перенесите покровные стекла в пустую лунку нового 24-луночного планшета и уравновесьте их в культуральной среде, соответствующей конкретному типу используемых клеток.

Теперь, после соответствующего времени инкубации, высейте клетки непосредственно на покровные стекла. Подготовьте образцы для иммунофлуоресцентного анализа с целью их фиксации. Нанесите каплю Prolong Gold Anti-Fade или аналогичного реагента на предметное стекло микроскопа, осторожно поместите на нее покровное стекло перевернутой стороной и получите изображения для анализа.

Данный анализ позволяет определить нормализованную площадь деградации матрикса относительно площади клеток или их количества. Это полезно при анализе всего микроскопического поля зрения, где присутствует несколько клеток, подвергнутых совместному воздействию факторов роста irna или терапевтических агентов. Для этого анализа используются изображения, полученные при меньшем увеличении, достаточном для эффективного сбора информации о популяциях клеток.

Откройте изображение в программе ImageJ. Проверьте информацию о масштабе и выберите параметры измерений. Выберите опции «Area» (площадь) и «Limit to Threshold» (ограничение по порогу). Рассчитайте площадь деградации по изображению флуоресцентного желатина, скорректировав неоднородность освещения желатина путем вычитания фонового порога; используйте изображение для установки верхних и нижних значений интенсивности пикселей.

На последующих изображениях. Используйте кнопку set в окне порога (threshold), чтобы установить одинаковый порог для всех изображений в качестве объективного способа выделения области деградации. Используйте функцию analyze particles для измерения порога в областях деградации матрикса.

Выберите размер частиц больше нуля, чтобы удалить шум из выделения. Включите отображение контуров для идентификации областей интереса. Затем отметьте пункты «отобразить результаты» (display results) и «сводка» (summarize) для вывода измерений, если на чертеже были специально обведены все области деградации.

Скопируйте значение общей площади в электронную таблицу; если были выбраны другие объекты, такие как клеточный детрит, фиксируйте площадь только соответствующих областей интереса. Для расчета площади клеток откройте функцию порога (threshold) на изображении с окрашиванием и установите верхнее и нижнее значения интенсивности пикселей так, чтобы на последующих изображениях были выделены границы клеток. Используйте кнопку «set» в окне порога, чтобы применить один и тот же порог ко всем изображениям.

Для объективного выбора области клеток используйте функцию анализа частиц (analyze particles), чтобы определить пороговое значение площади клеток. Выберите размер частиц больше нуля, чтобы удалить шум из области выделения.

Отобразите контуры, чтобы определить области для анализа, проверьте результаты отображения и создайте сводку для показа измерений площади. Не отмечайте этот пункт. Включите отверстия, если между клетками и кластером имеются промежутки.

Теперь сделайте выбор. Скопируйте результаты измерения площади соответствующих интересующих областей в электронную таблицу и рассчитайте площадь деградации желатина на общую площадь клеток. Альтернативным подходом является нормализация площади деградации по количеству клеток, определенному путем подсчета ядер, окрашенных DAPI.

Это важно, если манипуляции изменяют среднюю площадь клетки. Для данного подхода используйте плагин nucleus counter для автоматического подсчета ядер. Настройте параметры для оптимизации под ваши изображения. Если ядра сильно перекрывают друг друга, автоматический подсчет может не обеспечить точного перечисления в данном случае.

При правильном выполнении ручной подсчет можно облегчить с помощью плагина для подсчета клеток. Предметные стекла равномерно покрывают желатином, конъюгированным с Oregon Green 488. В процессе нанесения покрытия и обработки желатинизированных предметных стекол могут возникнуть различные артефакты.

Например, неравномерное покрытие возникает из-за неправильного заполнения покровного стекла в процессе нанесения слоя вследствие плохого перемешивания, ручного распределения или частичного затвердевания желатиновой смеси. Царапины свидетельствуют об удалении нанесенного матрикса при случайном повреждении иглами или пинцетом во время манипуляций. Высыхание поверхности покровного стекла при длительном хранении может привести к появлению структуры, напоминающей «булыжную мостовую». Данная область отражает фотообесцвечивание флуоресцентной желатиновой поверхности во время визуализации из-за длительного воздействия света или его высокой интенсивности.

Обратите внимание, что при микроскопическом исследовании правильно подготовленное покровное стекло демонстрирует гомогенную флуоресценцию. Тонкие матрицы, полученные в результате данной процедуры, представляют собой чувствительный инструмент для оценки способности клеток деградировать ECM. Например.

На данных изображениях запечатлена активность деградации матрикса подиума при инвазии клетки рака головы и шеи линии OSC 19. Клетки высевали на покровное стекло с желатином, конъюгированным с Oregon Green 488; визуализация проводилась с помощью флуоресцентной микроскопии, что представлено как в 2D, так и в 3D изображениях. Клетки OSC 19, высеянные на покровные стекла с конъюгированным Oregon Green 488 желатином, были маркированы конъюгированным с R-домином фибронектином и антителами к кортинактину, визуализированными с помощью вторичных антител ANOR 647; инвазированные области выделены псевдоцветом зеленого.

На совмещенном изображении подии видны как очаговые цитоплазматические скопления F-актина и кортанина, которые перекрываются с областями просветления желатина. Визуализация демонстрирует, как внедряющиеся подии проникают в подслой ECMA; данный ракурс был создан для отображения края внутри клетки, где присутствуют внедряющиеся подии. Вид с дорсального края показывает внедряющиеся подии, погруженные в нижележащий желатин.

Вид вентрального края демонстрирует протрузию в podia Veda, а области деградации желатина под покровным стеклом представлены красными зонами на зеленом матриксе. На этих изображениях показаны некоторые из важных этапов количественного определения нормализованной деградации матрикса желатина клетками в пределах всего микроскопического изображения. Все флуоресцентные изображения были преобразованы в градации серого для более наглядного отображения красного порога и отметок интересующих областей.

На данном изображении желатина, конъюгированного с Oregon Green 488, темные области указывают на места, где произошла деградация. После применения порога сегментации на изображении желатина выделяются области деградации, в которых измеряется площадь выбранных областей интереса. На этом изображении, как и ожидалось, видны румин, фоид и окрашивание F-актина.

Порог на изображении актина выделяет общую площадь клетки, из которой выбираются области клетки для измерения. Аналогичным образом этот метод может быть применен для анализа изображений ядер клеток, окрашенных DAPI. На данной панели продемонстрированы отдельные этапы количественного определения деградации флуоресцентного желатина отдельными клетками в смешанной клеточной популяции.

Эта простая количественная оценка проводится для одной трансфецированной клетки OSC 19, сверхэкспрессирующей рекомбинантный кортин-актин, слитый с флаг-эпитопной меткой. Обратите внимание, что деградация матрикса трансфецированными клетками может быть проанализирована и в смешанной популяции трансфецированных и нетрансфецированных клеток. При выполнении данной процедуры важно помнить о нескольких моментах.

Сначала убедитесь, что ваши флуоресцентные клеточные маркеры не перекрываются по цвету с флуоресцентным желатином. При сборе изображений важно выбирать поля обзора, основываясь на наличии клеток. Не ищите преимущественно области деградации, так как это может привести к систематической ошибке в данных из-за вариабельности клеточных линий и их ответов на различные терапевтические агенты.

Такие факторы, как время деградации количества посадочных мест и выбор белка для иммунофлуоресцентного мечения, должны быть оптимизированы для вашего конкретного эксперимента. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить покровные стекла с равномерным покрытием флуоресцентного желатина для анализов деградации, опосредованной бета-подиумами, а также о методах количественного определения деградации матрикса.