Векторной ДНК на основе РНК-интерференции по изучению функции генов в Раке

Общая цель данной процедуры — определение функции гена с помощью РНК-интерференции на основе ДНК-векторов. Сначала разрабатываются и создаются конструкции shRNA, нацеленные на специфические гены. Вторым этапом является получение лентивируса, несущего экспрессионную кассету shRNA.

Затем создаются стабильные клеточные линии путем заражения клеток лентивирусом, и эти зараженные клетки используются в различных анализах in vitro и in vivo для определения эффектов сайленсинга интересующего гена. В конечном итоге, в зависимости от используемых методов анализа, результаты могут показать изменения в туморогенности клеток вследствие нокдауна гена, что оценивается с помощью анализов пролиферации, миграции и инвазии in vitro, а также моделей формирования ксенографтов in vivo. Процедуру продемонстрируют Дэниел Стоуэлл и Ма Хуан; Дэниел — аспирант моей лаборатории, а Ма Хуан — техник.

Чанг — postdoctoral fellow. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, например, играет ли определенный ген роль в развитии и прогрессировании опухоли и для каких аспектов этих процессов он может быть значим. Для начала спроектируйте и закажите олигонуклеотиды согласно описанным критериям: два реверс-комплементарных олигонуклеотида, содержащих целевую последовательность длиной от 20 до 23 нуклеотидов в целевом гене.

На двух концах сформируются сайты EcoR1 и HindIII. После отжига другой олигонуклеотид, содержащий обратную комплементарную последовательность к целевой последовательности, своим 3'-концом отжигается на 3'-конец промотора H1 или U6 с помощью вышележащего праймера.

Используйте ПЦР для получения фрагмента, имеющего сайты BamHI и HindIII на обоих концах. Одновременно с этим проведите рестрикцию лентивирусного вектора и ПЦР-фрагмента. Затем выполните реакцию лигирования трех фрагментов: вектора, ПЦР-фрагмента и аннелированных олигонуклеотидов.

При молярном соотношении 1:10:10 полученный вектор обеспечит экспрессию интересующей hpRNA с последовательностью HindIII в области петли. Если используется индуцибельный вектор, продукция hpRNA будет зависеть от присутствия молекулы-индуктора, такой как доксициклин для системы Tet-on. Теперь проведите трансформацию высокоэффективных компетентных клеток E. coli DH5α, используя продукт лигирования, и идентифицируйте положительные векторы с помощью ПЦР-скрининга колоний.

Проведите амплификацию продукта, охватывающего вектор и сайт лигирования индуцибельного промотора. Выделите плазмидную ДНК из положительных колоний с помощью коммерческого набора. Затем подтвердите наличие вставки путем рестрикции BamH1 и EcoR1 и с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле.

Кроме того, проведите секвенирование области, содержащей промотор и S-H-R-N-A, используя LIGA nucleotide P five. С помощью набора для MIDI- или maxi-препарирования, не содержащего эндотоксинов, подготовьте ДНК лентивируса, несущую экспрессионную кассету HRNA. Определите концентрацию ДНК, измерив поглощение света на длине волны 260 нм, и убедитесь в чистоте ДНК, проверив, чтобы соотношение поглощения света на 260 и 280 нм находилось в диапазоне от 1,8 до 2,0.

Наконец, проведите электрофорез плазмиды лентивируса в аэрогеле, чтобы убедиться, что она находится в суперскрученном состоянии. Перед трансфекцией подготовьтесь к процедуре, медленно добавляя 0,9 мл раствора A к 0,9 мл раствора B, одновременно продувая раствор B воздухом с помощью пипетки. Затем инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого медленно нанесите по 0,6 мл смеси на три разные 10-сантиметровые чашки с клетками HEK 293 T.

Затем через четыре-шесть часов верните клетки в инкубатор. Замените среду на семь миллилитров полной среды DMEM. Через 24 часа добавьте еще пять миллилитров среды, а через следующие 24 часа соберите среду, содержащую лентивирус.

Центрифугируйте собранную среду при 1500 RPM при комнатной температуре в течение 10 минут. Профильтруйте супернатант через фильтр с порами 0,45 мкм. Осадите лентивирус из фильтрата путем ультрацентрифугирования.

Слейте супернатант в контейнер для отходов, содержащий 5% отбеливателя. Ресуспендируйте осадок лентивируса в 0,5–1 мл холодного 1x PBS. Затем разделите раствор лентивируса на аликвоты по 50–100 µL для хранения при температуре -80 °C.

Наконец, определите титр лентивируса с помощью надежного метода. Как правило, в чашке для культивирования диаметром 10 сантиметров вырабатывается от 50 до 100 миллионов инфекционных единиц перед тем, как переходить к заражению клеток. Для данной процедуры определите MOI титра лентивируса, используя специальный набор или метод R-T-P-C-R.

Рекомендуется использовать MOI ниже четырех. Начните с посева клеток, предназначенных для инфицирования, в шестилуночный планшет до достижения конфлюэнтности 30–40% и культивируйте их в течение ночи. На следующий день.

Замените среду на 1 мл свежей среды, содержащей полибрена или протамин. Затем добавьте от 1 до 2 млн IU лентивируса, содержащего флуоресцентный или антибиотический маркер.

Медленно встряхивайте планшет в течение 10 секунд для перемешивания и инкубируйте его в течение шести часов. Через шесть часов замените среду на обычную полную среду и культивируйте клетки в течение двух дней. Среды не должны содержать антибиотиков или индукторов независимо от того, какой лентивирус использовался, по истечении двух дней.

Добавьте соответствующий антибиотик, если лентивирус содержит антибиотический маркер. Аналогичным образом, добавьте индуктор в половину культур, если лентивирус является индуцибельным. После культивирования клеток в течение двух или трех дополнительных дней с антибиотиками и индукторами проведите вестерн-блот-анализ для проверки нокдауна целевого гена перед трипсинизацией клеток для ксенотрансплантации.

Соберите клетки из больших чашек для культивирования и ресуспендируйте их в исходной среде, содержащей 50% Matrigel. Крайне важно держать суспензию раковых клеток в 50% Matrigel и шприц на льду. В противном случае существует риск затвердевания Matrigel, что может привести к порче образца.

Подготовьте место хирургического вмешательства, тщательно очистив его 70% ethanol, и проведите анестезию при отличной вентиляции с фильтром-поглотителем isof fluorine, прикрепленным к индукционной камере. Проведите анестезию мышей линии thymic nude, используя 2% isof fluorine в смеси с 1.5% oxygen за три-пять минут до инокуляции клеток. Затем поддерживайте анестезию, используя 2% isof fluorine в смеси с oxygen через носовой конус.

Поместите мышь на грелку, настроенную на 30 °C. Загрузите клетки в шприцы с иглами калибра 25,5 для подкожных инъекций или с иглами калибра от 28 до 30 для ортотопических инъекций. Через пять минут после введения анестезии введите от 1 до 10 миллионов клеток болюсами по 200 µL в одном или двух участках.

Количество клеток зависит от степени злокачественности или агрессивности раковых клеток. Для конститутивно активных векторов используйте две группы мышей, которым вводят клетки, экспрессирующие либо целевой ген S-H-R-N-A, либо скрамблированную последовательность S-H-R-N-A на векторах. Используйте те же две группы и разделите каждую из них на подгруппы, которым в воду добавляют или не добавляют индуктор.

Заменяйте воду в поилках дважды в неделю. Контролируйте объем опухолей еженедельно или раз в две недели с помощью штангенциркуля. Следите за тем, чтобы объем опухоли не превышал лимит, установленный учреждением или комитетом по уходу и использованию животных (IACUC), и эвтаназируйте животных при появлении обширных изъязвлений, некроза, явных признаков инфекции, неконтролируемого кровотечения или при переходе болезни в терминальную стадию. Для мониторинга роста опухоли и метастазирования с помощью биолюминесцентного маркера продезинфицируйте рабочую зону и анестезируйте мышей в камере для визуализации с использованием газообразного наркоза.

Сначала проведите экспозицию продолжительностью от двух до пяти минут, проверьте интенсивность сигнала и при необходимости отрегулируйте параметры. Если размер опухоли превышает 1000 кубических миллиметров или установленный в учреждении лимит, проведите эвтаназию животного при жертвовании, задокументируйте размер опухоли и сохраните ее для дальнейшего анализа. Данный протокол использовался для изучения влияния нокдауна why Y one на формирование ксенографтов опухолей из экспрессирующих люциферазу клеток аденокарциномы молочной железы человека, имплантированных атимическим обнаженным мышам.

Были протестированы целевая последовательность S-H-R-N-A для человеческого белка YY1 и скрамблированный контрольный S-H-R-N-A, не имеющий значительного сходства с каким-либо известным человеческим транскриптом. В результате были сконструированы два лентивирусных вектора, которые использовались для получения двух лентивирусов. Оба вируса были использованы для заражения двух различных популяций клеток, в результате чего были получены поликлональные популяции клеток.

После селекции пуромицином вестерн-блот-анализ подтвердил нокдаун YY1, индуцированный DS, в этих инфицированных клеточных линиях. Далее была использована поликлональная популяция клеток клона три, инфицированных индуцибельной shRNA к YY1 и контрольной shRNA.

Для изучения влияния истощения YY1 на инвазию использовали ЛЕНТИВИРУСЫ. Мы обнаружили, что истощение YY1 снижало инвазивную способность клеток. Вестерн-блот-анализ подтвердил индуцированное подавление YY1 в клетках с индуцибельной shRNA к YY1, в то время как в клетках, содержащих контрольную shRNA, уровень экспрессии оставался неизменным.

S-H-R-N-A не проявила данного эффекта. Затем эти клетки были использованы в исследовании на мышиной модели ксенографта в сравнении с контрольными группами indu, YY one; у мышей с имплантированными клетками S-H-R-N-A, получавших воду в качестве растворителя, наблюдалось ожидаемое значительное снижение образования опухолей при визуализации методом биолюминесценции и при измерении массы опухолей. Сайленсинг YY one в этих ксенографтных опухолях был легко подтвержден с помощью вестерн-блоттинга.

Исследования: не забывайте, что работа с лентивирусом может быть крайне опасной; согласно правилам безопасности NIHB при проведении исследований с лентивирусными векторами, для всех лабораторных условий требуются процедуры обеспечения безопасности второго уровня биологической защиты (BSL-2).