Малая ядерная Экстракты для функционального анализов экспрессии генов Machineries

Общая цель следующего эксперимента заключается в анализе экспрессии генов с использованием функциональных ядерных механизмов, экстрагированных из клеток. Для этого сначала проводят сбор и набухание клеток HeLa. Затем клетки подвергают лизису путем осаждения, после чего на третьем этапе центрифугируют для получения осадка ядер.

Ядра подвергаются солевой экстракции, концентрированию и диализу для получения растворимых и функциональных механизмов экспрессии генов. В конечном итоге функциональность ядерных экстрактов может быть оценена на основе их транскрипционной и сплайсинговой активности с помощью сопряженной системы транскрипции и сплайсинга РНК-полимеразы. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими способами, такими как приготовление общего ядерного экстракта, является то, что данный метод позволяет использовать небольшое количество клеток для получения ядерного экстракта.

Начните с высева клеток HeLa на три чашки диаметром 150 мм с использованием среды DMEM, дополненной FBS и антибиотиками; культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 до достижения 90% конфлюэнтности. На этом этапе аспирируйте среду из культур клеток HeLa и один раз промойте их 13 мл PBS комнатной температуры на каждую чашку, затем аспирируйте PBS. Наклоните каждую чашку на бок на несколько секунд и аспирируйте остатки PBS.

Затем с помощью скребка для клеток (cell lifter) соберите клетки у нижнего края каждой лунки, после чего перенесите их в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 миллилитра. В завершение осадите клетки в микроцентрифуге в течение пяти минут при 100 ×g и температуре 4 °C. Теперь аспирируйте PBS из осадка клеток и оцените гематокрит (PCV), ориентируясь по шкале на пробирке.

Затем добавьте к осадку клеток гипотонический буфер в объеме, в два раза превышающем показатель PCV. Осторожно встряхните пробирку для ресуспендирования. При необходимости аккуратно пропипетируйте клеточную суспензию вверх и вниз с помощью пипетки на 1000 µL, чтобы разрушить скопления клеток.

Затем осадите клетки в центрифуге при тех же условиях, что и ранее. После центрифугирования осторожно аспирируйте слой гипотонического буфера. Клетки начнут набухать, и их объем увеличится примерно до 750–1000 µL.

Добавьте новый гипотонический буфер до конечного объема 1,5 milliliters и снова ресуспендируйте клетки в буфере. В завершение инкубируйте ресуспендированные набухшие клетки на льду в течение 10 минут для их охлаждения. Промойте гомогенизатор гипотоническим буфером, после чего поместите его на лед вместе с клетками.

Затем, используя безворсовую салфетку (например, Kimwipe), просушите пестик. С помощью удлиненного наконечника микропипетки на 1000 µL удалите буфер из пробирки. Теперь с помощью пипетки перенесите охлажденные набухшие клетки в пробирку.

Самым сложным этапом данной процедуры, определяющим успех, является проверка лизиса. После каждого этапа при осмотре под микроскопом медленно перемещайте плотный пестик в пробирке вверх и вниз пять раз для лизиса клеток, стараясь избегать образования пузырьков. Затем перенесите 5 µL аликвоты суспензии лизированных клеток в микроцентрифужную пробирку, добавьте 10 µL трипанового синего и 15 µL 1×PBS.

Нанесите клеточный раствор на предметное стекло и исследуйте клетки под световым микроскопом на предмет лизиса; ядра лизированных клеток станут синими через три часа. Лизис недостаточен, так как наблюдается большое количество живых клеток. Через пять часов степень лизиса становится достаточной.

Наконец, перенесите лизированные клетки в предварительно охлажденную пробирку Эппендорфа и центрифугируйте клеточную суспензию в течение пяти минут в микроцентрифуге при 1500 ×g и температуре 4 °C. Затем аккуратно перенесите супернатант в новую пробирку, не затрагивая осадок. Теперь оцените объем ядерного патча (PNV), ориентируясь по шкале на пробирке.

Наберите в наконечник микропипетки низкосолевой буфер в объеме, равном половине PNV. Затем введите наконечник микропипетки в суспензию ядер на дне пробирки Эппендорфа. Медленно впрыскивайте буфер в ядра, аккуратно перемешивая содержимое.

Осторожно постучите по пробирке, чтобы убедиться, что осадок полностью ресуспендирован. Затем добавьте буфер с высоким содержанием соли в объеме, равном одной половине PNV, и быстро перемешайте, один раз перевернув пробирку. Инкубируйте пробирку в ротаторе в течение 30 минут при температуре four degrees Celsius.

Наконец, осадите ядра в микроцентрифуге в течение 15 минут при 18 000 ×g и 4 °C. Перенесите 500 µL супернатанта в охлажденные микроконцентраторы. Центрифугируйте ядерный экстракт с высоким содержанием соли в течение 15 минут при 14 000 ×g и 4 °C, после чего переверните мини-ракон и поместите его в новую индивидуальную пробирку EPR.

После центрифугирования в течение двух минут при 1000 ×g и температуре 4 °C объем ядерного экстракта с высоким содержанием соли сократится примерно до 115 µL. Теперь перенесите аликвоты по 45 µL этого экстракта в мини-диализные SLI. Убедитесь, что нижняя часть предметного стекла прилегает к дну поплавка.

Затем поместите SLI в 500 миллилитров охлажденного диализного буфера. В завершение перемешивайте аликвоты в течение одного-двух часов при температуре 4 °C; после диализа ядерный экстракт станет мутным. На этом рисунке представлены репрезентативные данные сравнения сопряженной реакции транскрипции РНК-полимеразой II и сплайсинга в малом объеме ядерного экстракта и в большом объеме ядерного экстракта.

При инкубации конструкции A-C-M-V-D-N-A в экстрактах, полученных в большом или малом масштабе, к пятой минуте после добавления альфа-аманитина для блокирования дальнейшей транскрипции синтезировались сходные уровни нативной пре-мРНК; интермедиаты сплайсинга и продукты сплайсинга накапливались с течением времени с аналогичной кинетикой в обоих типах экстрактов. Эти репрезентативные результаты подтверждают, что эффективность сопряженной системы транскрипции РНК-полимеразой II и сплайсинга схожа в ядерных экстрактах, полученных в большом и малом масштабе. Чтобы продемонстрировать применимость экстракта, полученного в малом масштабе, были подготовлены экстракты из клеток HeLa, обработанных ингибитором сплайсинга E 7 1 0 7 или соединением отрицательного контроля Platy analy F, после чего был проведен анализ сопряженной транскрипции РНК-полимеразой II и сплайсинга, как показано на данной фигуре; транскрипция РНК-полимеразой II эффективно протекала в экстрактах, приготовленных как из клеток, обработанных Platy analy F, так и из клеток, обработанных E 7 1 0 7.

Напротив, сплайсинг происходил нормально в экстракте, приготовленном из клеток, обработанных analy F, но был полностью подавлен в клетках, обработанных E 7 1 0 7. Эти данные служат доказательством концепции использования ядерных экстрактов в малом масштабе для специальной обработки клеток в малом объеме. После освоения эта методика может быть выполнена менее чем за пять часов.