Постоянное давление контролируемый методом экструзии для приготовления наноразмерных липидных везикул

Общая цель следующего эксперимента — представить надежный метод подготовки биологически значимых липидных везикул. Это достигается путем смешивания и переноса фосфолипидов в стеклянные флаконы с последующей гидратацией водным буфером для создания многослойной суспензии SLE. На втором этапе применяется метод замораживания и оттаивания, что в конечном итоге приводит к образованию однослойных везикул из многослойных везикул.

Затем суспензию липосом пропускают через экструдер при определенном оптимальном давлении для получения однородных липидных везикул желаемого размера. Полученные результаты, основанные на методах динамического рассеяния света и анализе траекторий наночастиц, демонстрируют стабильный субмикронный размер везикул. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как соникация и седиментация, является использование системы контроля давления с определенной оптимальной скоростью потока азота для эффективного получения липидных везикул заданного размера.

Для начала данной процедуры возьмите стеклянный флакон объемом 20 milliliter с крышкой, выложенной тефлоном; перед использованием очистите всю стеклянную посуду и шприцы хлороформом для предотвращения загрязнения. Перенесите 100 microliters хлороформа квалификации «чистый для анализа» в стеклянный флакон, используя герметичный стеклянный шприц объемом 250 microliter. Добавьте 30 microliters метанола квалификации «чистый для анализа» в тот же стеклянный флакон, используя герметичный стеклянный шприц объемом 100 microliter.

Приготовьте 2 мM раствор липидов POPC, POPE и холестерина, перенеся 216 мкл 10 мг/мл POPC, 42 мкл 10 мг/мл POPE и 20 мкл 11 мг/мл холестерина в стеклянный флакон объемом 20 мл. Испарите органические растворители при медленном потоке аргона или азота до образования тонкой липидной пленки на дне флакона, затем поместите открытый стеклянный флакон в вакуумный эксикатор минимум на 30 минут.

Для удаления остаточного растворителя перенесите в стеклянный флакон два миллилитра буфера, предварительно прошедшего через фильтр 0,2 мкм, чтобы гидратировать липиды. Инкубируйте смесь при температуре 4 °C в течение ночи; для липосом размером от 30 до 100 нм используйте препарат в течение 48 часов. Заморозьте суспензию липосом в жидком азоте в течение 15 секунд.

Затем разморозьте суспензию липосом с помощью нагревательного блока при 42 °C в течение примерно трех минут. Повторите процесс замораживания-оттаивания в общей сложности пять раз. Замораживание с последующим оттаиванием способствует переходу от многоламеллярных везикул к одноламеллярным и повышает эффективность захвата липидов при экструзии.

Затем подготовьтесь к экструзии, следуя инструкциям Avastin, чтобы аккуратно собрать экструдер lipo so fast. LF 50; правильная сборка имеет решающее значение для предотвращения утечки азота, что влияет на требуемую скорость потока. Для обеспечения успеха тщательно выполните следующие шаги.

Для обеспечения герметичности установите сетку с большими отверстиями в основание опорного фильтра, затем поместите туда круглый центральный диск, один дренажный диск и одну поликарбонатную мембрану. Поместите маленькое черное уплотнительное кольцо поверх мембраны и закрепите его в основании опорного фильтра.

Прикрепите верхний экструдер фильтра, затянув четыре винта в четырех соответствующих отверстиях. Установите блок экструдера фильтра под большой цилиндр экструдера. Добавьте раствор липосом в цилиндр, расположенный над экструзионным цилиндром.

Установите большое круглое уплотнительное кольцо, узкую крышку, большое круглое уплотнительное кольцо и круглую крышку. Прикрепите газовый регулятор к верхней части ствола экструдера и закройте все клапаны, включая предохранительный клапан, для предотвращения утечки воздуха. Поместите стеклянный флакон объемом 20 milliliter или колбу Эрленмейера объемом 50 milliliter под фильтрующий узел экструдера.

Предохранительный клапан подключен к регулятору и сработает, если давление превысит 600 PSI. Я включаю подачу азота и открываю газовый клапан, подключенный к экструдеру. Увеличиваю давление азота до 25 PSI для получения липосом размером 400 нм, до 125 PSI для липосом размером 100 нм и до 400–500 PSI для липосом размером 30 нм. Наблюдаю за суспензией липосом до тех пор, пока она под давлением азота не вытеснит в контейнер.

Продолжайте подачу азота до тех пор, пока не исчезнет жидкость. Пропустите раствор через фильтр экструдера в стеклянную виалу для проведения DLS-анализа. Сначала приготовьте 50 µL 20 µM раствора липосом, разведенного в фосфатно-солевом буфере или PBS.

Затем включите источник питания и источник света. Запустите программное обеспечение Dynapro. В программе выберите модель алгоритма для обнаружения липосом требуемого размера.

После подключения к оборудованию с помощью пипетки внесите 14 µL образца липосом в кварцевую кювету и установите её в держатель кювет; нажмите кнопку запуска и после примерно 20–30 циклов сбора данных нажмите кнопку остановки. Проанализируйте пики среднего диаметра липосом, зафиксированные на гистограмме. Анализ траекторий наночастиц начинается с приготовления 500 µL 0,1 µM раствора липосом, растворенных в PBS; промойте отделение для образца водой и этанолом.

Затем просушите отделение для образца безворсовой бумажной салфеткой. Включите источник питания лазера и компьютер, после чего внесите 300 µL 0,1 M раствора липосом в отделение для образца. Откройте программу управления температурой и программное обеспечение для анализа трекинга наночастиц.

Нажмите кнопку захвата, чтобы включить лазер. Используйте горизонтальную и вертикальную регулировки для перемещения предметного столика и настройки фокуса микроскопа. Установите желаемую температуру и время записи.

Нажмите кнопку записи, чтобы сделать серию снимков частиц липосом в течение заданного времени. Проанализируйте пики, соответствующие диаметру липосом на гистограмме, по мере отслеживания движения каждой частицы. DLS является общепринятым методом сбора рассеянного света для определения диаметра частиц; данный метод был использован для определения размеров липосом.

Гидратированные липосомы подвергали экструзии через поликарбонатные мембраны с различными размерами пор и при разном давлении, как описано в письменном протоколе. Диаметры липосом, измеренные методом DLS, составили 66 ± 28 nm для размера пор 30 nm, 138 ± 80 nm для размера пор 100 nm и 360 ± 25 nm для размера пор 400 nm.

В качестве калибровочного стандарта использовали суспензию полированных частиц Irene диаметром 50 nanometer, при этом зафиксированный диаметр составил 47 ± 16 nanometers. Процент полидисперсности указывает на отсутствие перекрытия размеров липосом. При использовании DLS-анализа обычно наблюдаются диаметры более 30 nanometers из-за известной склонности данного прибора к определению более крупных частиц.

Несмотря на это инструментальное ограничение, калибровочная кривая описывает линейную корреляцию. Анализ траекторий наночастиц представляет собой новую технологию, позволяющую измерять размер каждой частицы путем прямого наблюдения за диффузией в жидкой среде независимо от показателя преломления или плотности частиц. Этот метод высокого разрешения может быть использован в дополнение к измерению липосом с помощью DLS; при этом NTA зафиксировал диаметры 95 ± 48 нм и 356 ± 51 нм для двух растворов полистирола с размером частиц 100 нм и 400 нм, которые использовались для калибровки.

Растворы липидов имеют более сопоставимый диаметр по данным DLS, при этом средние размеры составили 29 ± 14 нм для размера пор 30 нм, 95 ± 17 нм для размера пор 100 нм и 359 ± 73 нм для размера пор 400 нм. NTA может быть более универсальным методом характеризации для количественного определения микроскопических частиц, так как его чувствительность позволяет измерять частицы размером от 50 до 1000 нм. Калибровочная кривая демонстрирует линейную корреляцию между размером пор поликарбонатной мембраны и зарегистрированным диаметром по данным NTA. Снимки просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием показывают, что размеры каждой липосомы после экструзии через поры 3, 100 и 400 нм четко отличаются друг от друга.

Увеличение было установлено на уровне 25 000 крат, при этом масштабный отрезок соответствует 0,5 microns. Эксперимент по изучению временной зависимости был проведен с использованием липосом трех различных размеров. DLS измеряли для каждого раствора липосом сразу после экструзии.

Все растворы липосом хранили при температуре four degrees Celsius в течение ночи. После ночной инкубации их диаметры снова измеряли методом DLS. После 60-часового периода инкубации изменений практически не наблюдалось. При выполнении данной процедуры важно помнить, что многократное пропускание через экструзионный фильтр повышает гомогенность раствора везикул.

Также помните, что для подготовки проб следует использовать стеклянные флаконы и шприцы, чтобы предотвратить загрязнение продуктами вымывания из полипропиленовых пробирок хлороформом.